In situ cell death monitoring in 3D tissue cultures using surface enhanced Raman spectroscopy

Abstract

İlaç keşfi ve doku rejenerasyon çalışmalarında kullanılan üç boyutlu (3B) in vitro kültürler, yıkıcı, yoğun emek gerektiren ve yüksek maliyetli in vivo çalışmaların zorluklarını atlatabilirler. Ancak, 3B kültürlerde hücresel tepkiyi izlemek için kullanılan geleneksel teknikler, mekansal olarak dağıtılmış gerçek zamanlı değerli bilginin kaybedilmesiyle sonuçlanan 3B yapının fiksasyonuna ve buna bağlı olarak 3B yapının bozulmasına bağlıdır. Raman spektroskopi (RS) modlarından biri olan yüzeyde zenginleştirilmiş Raman spektroskopisi (SERS), tahribatsız ve etiketsiz algılama niteliğinden dolayı, son zamanlarda canlı hücre analizine kullanımı büyük ilgi kazandı. Bu tezde, SERS'e dayalı bir yaklaşım, 3D kültürlerdeki hücre ölümünü yerinde izlemek üzere değerlendirildi. Ortalama boyutu 50 nm olan altın nanopartiküller (AuNP'ler) SERS substratı olarak kullanıldı. AuNP'ler, tek katmanlı kültürde hücrelere endositoz yoluyla yerleştirildi. Geçirimli elektron mikroskobu (TEM) görüntüleri, AuNP'ler hücre içine alındığını ve endosomal veziküllerde toplandığını gösterdi. Daha sonra SERS analizi için hücrelerin hazırlanması, optimum spektral elde edilmesi için enstrümantal parametrelerin optimizasyonu ve veri işleme adımları tek katmanlı kültürde değerlendirildi. Kanser ilaçlarına hücrelerin yanıtının, endozomal veziküllerdeki biyokimyasal değişikliklerden SERS spektrumuna yansımasıyla izlendi. Ardından, 3B sferoit kültürü, AuNP-almış hücrelerin asılı damla içinde inkübasyonu ile hazırlandı. Oluşan sferoitler, ışık mikroskobu, taramalı elektron mikroskobu (SEM) ve TEM ile karakterize edildi. Bütünlüğü korunan sferoitin derinlik katmanlarına göre kanser ilaçlarına verdiği yanıt SERS ile analiz edildiğinde, indüklenen apoptotik hücre ölümünden dolayı sferoidin yüzeyine yakın tabakalardan endolizozomal zara ait 550 cm-1, 590 cm-1 ve 710 cm-1 civarında kolajen, fosfat ve C-C lipid piklerin ortaya çıkmasına ek olarak protein yapılarına karşılık gelen piklerde değişikliklere neden olduğu gözlemlendi. Sonuçlar, SERS'e dayalı yaklaşımın, 3B sferoit kültürde bir ilacın etkinliğini ilaç penetrasyon oranına bağlı olarak izlenebileceğini göstermiştir.

Three dimensional (3D) in vitro cultures used in drug discovery and tissue regeneration studies can circumvent the difficulties of destructive, labor intensive and high cost in vivo studies. However, the conventional techniques to monitor cellular response of 3D cultures depend on fixation and dependently destruction of the 3D structure, which results with loss of the spatially distributed valuable real time information. Surface enhanced Raman spectroscopy (SERS), one of the Raman spectroscopy (RS) modes have recently gained interest in living cell analysis due to the non-destructive and label free detection nature. In this thesis, a SERS based approach was evaluated to monitor in situ cell death in 3D cultures. Gold nanoparticles (AuNPs) with 50 nm of average size were used as SERS substrates. The AuNPs were placed into the cells via endocytosis in monolayer culture. Transmission electron microscopy (TEM) images showed that the AuNPs were uptaken and aggregated in endosomal vesicles. Then, the preparation of cells for SERS analysis, optimization of instrumental parameters for spectral acquisition and data processing steps were evaluated in monolayer culture. The cellular response to anti-cancer drugs was monitored from the biochemical changes in endolysosomal vesicles reflected on SERS spectra. Then, 3D spheroid culture was prepared by incubating the AuNP-treated-cells in hanging drop. The prepared spheroids were characterized with bright field microscopy, scanning electron microscopy (SEM) and TEM. When the response of intact spheroid to anti-cancer drugs was analyzed through the depth layers into the spheroids using SERS, the peaks corresponding to endosomal membrane structures, which were collagen, phosphate and C-C vibrations of lipids, were arised around 550 cm-1, 590 cm-1 and 710 cm-1 in addition to spectral variations in protein structures from the layers closer to the surface of the spheroids due to the induced apoptotic cell death. The results show that SERS-based approach can be used to monitor the efficacy of anti-cancer drugs in 3D spheroid culture depending on the drug penetration rate.