Investigation of Warburg effect in mammalian cancer cell lines by studying various metabolic enzymes and assays

Abstract

TUİK'in 01.04.2014 tarihli raporunda açıkladığı üzere, tümor oluşumları ölüm oranlarında yüzde 21,3 ile en yüksek ikinci orana sahip olmakla birlikte; daha önce yapılmış çalışmalarda kanser hücreleri; iç ve dış metabolik yolaklarına ek olarak sinyal yolaklarından bazılarını azaltıcı veya komple etkisiz hale getirecek yönde görevli olan protein yapılarını değiştirebilme özelliklerine sahip olmakla birlikte, spesifik olarak glikolitik, oksidatif fosforilasyon ve apoptotik yolakları ile apoptozda yer alan Kaspaz-9 (Kasp-9) ve Kaspaz-3 (Kasp-3) yapılarını ve yolaklarını değiştirebilmektedirler. ATP sentezi, iki yolakta oldukça önemli rollere sahip olmakla birlikte, bunlardan birincisi olan glikolitik yolağın, oksijen varlığından bağımsız olarak, azalan TCA döngüsünün ürettiği enerji açığını kapatmak ve ATP üretmek için kanser hücreleri tarafından yoğunlukla tercih edilmesi durumu, Warburg etkisi olarak açıklanmıştır. Glikoz taşıyıcıları (GLUTs), özellikle GLUT4, glikoliz yolağında aktif bir şekilde glikozun hücre içerisine taşınmasında rol oynayan ve ayrıca farklı hücre hatlarında farklı ekpresyon seviyelerine sahip olduğunun gösterilmesi amaç edinilmiştir; tümor ve GLUT4 baskılayıcısı olarak da bilinen, tümor proteini p53 (TP53), araştırılmıştır. Ayrıca, glikoz moleküllerinin oksijenli solunum yoluyla ATP üretiminden başlıca sorumlu olan OXPHOS kompleksleri araştırılan önemli moleküllerden biridir. Ayrıca, elektron taşıma sisteminde oksijenin indirgenerek, su moleküllerinin üretiminden sorumlu olduğu için, kompleks IV molekülü araştırılmıştır. İmmün-emdirim analizleri, OXPHOS kompleksleri, GLUT4, Casp-3, Casp-9, p53 ile normal oksijen seviyesinde büyütülen PNT1A, DU 145, HeLa, Hep 3B, HEK 293T ve SH-SY5Y hücre hatlarında araştırılmıştır. ATP Sentaz Aktivite Analizi, Kompleks V aktivite seviyelerinin ölçülmesi ve Rhodamine123 (Rh123) boyası ise mitokondriyal zar potansiyel farklarının karşılaştırılması için kullanmıştır.

Tumor formations are the cause of the cancer death that constitutes second highest mortality rate with 21.3 per cent, published by TUIK in 04.01.2014. Studies have revealed that cancer cells alter their metabolic pathways including intrinsic and extrinsic pathways, also protein structures that initiate the 'molecular-protocol' of silencing to block several pathways, most commonly glycolytic, oxidative phosphorylation and apoptotic pathways, specifically, Caspase-9 (Cas-9) and Caspase-3 (Cas-3) are the molecular lynchpins. In this phenomenon, ATP synthesis has a vital role upon glycolytic pathway, which has recorded to be significantly preferred independently from oxygen levels by cancer cells to reach breakeven point with diminishing TCA cycle, and to generate abundant amount of ATP, in terms of energy requirement, also known as Warburg effect. In glycolysis, Glucose transporters (GLUTs), specifically GLUT4, are active structures responsible for glucose intake, hence, profiling differential expression level of this structure in proteomic prospects, considering various cell types, was the purpose of this study, as per to our means, tumor suppressor protein p53, crucial tumor suppressor and a proved GLUT4 down-regulator, additionally, respiratory chain (RC) complexes, in ATP synthesis by oxidative respiration of glucose structures, have investigated. Besides, Complex IV, which holds a significant role in electron transfer chain by reducing oxygen into the water molecules, was investigated. Immunoblotting assays performed against ETC complexes, GLUT4, Casp-3, Casp-9, p53 in PNT1A, DU 145, HeLa, Hep 3B, HEK 293T and SH-SY5Y cell lines to investigate variations under normoxic condition. ATP Synthase Activity Assay was applied to measure Complex V activity levels, and Rhodamine123 (Rh123) dye was applied to compare mitochondrial membrane potential with corresponding cell lines.