Development of an in situ sers based method for observation of biofilm formation

Abstract

Biyofilm, mikrobiyal hücrelerden ve hücre dışı polimerik maddelerden oluşan bir bileşimdir. Hücre dışı polimerik maddeler, mikroorganizmaların bir yüzeye geri dönüşümsüz olarak bağlanmasını sağlar ve onları çevresel stres koşullarından korur. Biyofilm oluşumu sırasında moleküler değişikliklerin yerinde izlenmesi, tıp, biyoloji ve ilgili endüstri alanları için değerli bilgiler sağlayabilir. Geleneksel olarak kullanılan moleküler ve mikroskobik teknikler, örnek hazırlama aşamalarının zorluğu sebebi ile zaman alıcıdır ve örnek hazırlama sürecinde biyofilmin yaşayan kaotik sistemini bozmaktadır. Bu çalışmada, biyofilm oluşumunun daha iyi anlaşılması ve tespit edilmesi amacı için klinik olarak önemli mikroorganizmalar olan Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus epidermidis ve Candida albicans'ın biyofilm oluşumu yüzeyde zenginleştirilmiş Raman saçılması (YZRS) ile izlendi.Klinik açıdan önemli olan mikroorganizmalar, polimerik medikal cihazlar ve implantlar gibi çeşitli yüzeyler üzerinde biyofilm oluşturarak hastaların sağlıklarını tehdit etmektedir. Bu tez çalışmasında model mikroorganizmaların agar plakalarda, 2D ve 3D poli (metil metakrilat) yüzeylerde ve 3D glikoz-jelatin yapı iskeleti üzerinde biyofilm oluşturma süreçleri belirlendi ve yüzey tipinin biyofilm oluşumuna etkisi gösterildi. Spektrumlarda artan inkübasyon süresi ile birlikte karbonhidrat, lipid, protein ve genetik materyallerdeki önemli konsantrasyon değişiklikleri belirlenerek mikroorganizmaların biyofilm oluşum süreci moleküler düzeyde aydınlatıldı. Ayrıca, elde edilen spektral bilgiler konfokal lazer taramalı mikroskobu ve taramalı elektron mikroskobu kullanılarak teyit edildi. Belirlenen inkübasyon sürelerinde biyofilm oluşturan mikroorganizmaların ayrılması, SERS spektrumları kullanılarak temel bileşen analizi ve doğrusal ayırma analizi ile gösterildi. Geliştirilen metodun klinik uygulamalarda kullanılabilmesi için çoklu tür içeren biyofilm örnekleri SERS ile analiz edildi. Sonuç olarak, elde edilen çıktılar SERS tekniğinin klinik önemi olan biyofilmin analizi için kullanılmasının kapsamlı bir araştırmasını ortaya koymaktadır.

A biofilm is an assembly composed of microbial cells and extracellular polymeric substances, which provides and supports microorganisms for attach themselves onto a surface irreversibly and protect them from environmental stress conditions. Monitoring the in situ molecular changes during a biofilm formation can provide valuable insights in the fields including medicine, biology and related industrial processes. The conventional molecular and microscopy techniques are time consuming due to cumbersome sample preparation steps and destructive nature. With the aim of better understanding biofilm formation and possibility of detection, in this study, biofilm formation of clinically important microorganisms, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus epidermidis and Candida albicans were monitored by utilizing surface-enhanced Raman scattering (SERS).Clinically relevant microorganisms threaten patient health often through biofilm formation on the surface of polymeric medical devices and implants. In this thesis work, the biofilm characteristics of the model microorganisms were identified on agar plates, 2D and 3D poly (methyl methacrylate) substrates and 3D glucose-gelatin scaffolds with the aim of understanding the influence of substrate type on biofilm formation process. The significant concentration changes on carbohydrates, lipids, proteins and genetic materials with increasing incubation time provided information about biofilm formation process. Moreover, the spectral data was attempted to confirm with confocal laser scanning microscopy and scanning electron microscopy analyses. The discrimination of microorganisms was also demonstrated from the SERS spectra using principle component analysis and linear discrimination analysis. A further step was taken in the way to clinical application of the approach by monitoring biofilm formation by using a multi-species sample. In summary, the results present a comprehensive evaluation of the applicability of SERS in clinically relevant biofilm formation with exciting outputs and opportunities.