Elimination of cytotoxic and genotoxic barriers during course of HSC expansion with pifithrin alpha treatment

Abstract

Hematopoietik kök hücreler (HSC'ler) çok çeşitli kan hastalıklarının tedavisinde uygulanmaktadır. Bununla birlikte, sınırlı sayıda ve durgunluk özelliği kök hücre tedavisinde kullanılmalarını zorlaştırmaktadır. HSC'lerin ex vivo genişlemesi ve çoğalmasını sağlamak adına küçük moleküllerle çeşitli çalışmalar sürdürülmektedir. Bilindiği üzere; P53'un genetik inhibisyonunun, hematopoietik kök hücrelerin (HSC'ler) çoğalmasına yol açtığı gösterilmiştir. Pifithrin-aplha küçük moleküllü bir bileşik ve p53 fonksiyonunun önleyicisidir ve genotoksik ajanlara karşı önlem olduğu bilinmektedir. Bu çalışmada; pifithrin-aplha molekülünün HSC hücreleri üzerindeki etkileri araştırıldı. Bu amaçla, fare HSC'leri, manyetik soy soyutlama yöntemi ile zenginleştirildi. İnsan umbilikal kordon kanı (UCB) ve kemik yapılı (BM) mononukleer hücreler histopak yoğunluk gradient santrifuju ile izole edildi. Hücreler hazırlanan HSC medyası ile uygun koşullarda kültür edilirken kontrol olarak DMSO tedavisi kullanıldı. Pifithrin-aplha küçük molekülü ile yedi günlük inkübasyondan sonrasında fare HSC'leri lin (-), sca1, c-kit, ÇD34 markörleri için analiz edildi. Aynı şekilde insan HSC'leri için ise CD34 ve CD133 markörleri için analiz edildi. FACS ile saflaştırılmış fare LSK hücrelerinin seçilen en uygun doz molekül ile kuluçkaya yatırılmasını takiben hücre döngüsü analizi ve apoptoz analizi yapılmıştır. Aynı zamanda, İnsan Umbilikal Ven Endotel Hücrelerini (HUVEC) ve İnsan Dermal Fibroblast (HDF) ve yağ dokusundan elde edilen MSC'ler üzerinde de etkisi incelenmiş ve olumsuz bir etki göstermemiştir. Pifithrin-aplha küçük molekülü, LSK (lin-sca1 + c-kit +) ve insan UCB HSC hücrelerinde 3 kat artışa neden olmuştur. Benzer şekilde, insan BM HSC hücrelerinde 2 kat artışına neden olmuştur.Aynı zamanda, tavuk HSC izole edilip, yüzey marker taraması gerçekleştirildi. Böylece; kuş gribi gibi hastalıkların araştırılması ve insan HSC'lerinde oluşan etkilerinin önlenmesi için olanaklar araştırıldı.Sonuç olarak, bu molekülün ex vivo HSC genişlemesini ve tedavi verimliliğini artırmak için kullanılabileceği düşünülmektedir.

Hematopoietic stem cells (HSCs) are used in the treatment of a extensive range of blood diseases. However, the limited number and stagnation feature make it difficult to use in stem cell treatment. Numerous studies have been carried out with small molecules to ensure the expansion and multiplication of HSCs ex vivo. As known; Genetic inhibition of P53 has been shown to lead to the proliferation of hematopoietic stem cells (HSCs). The pifithrin-apla is a small molecule compound and the inhibitor of p53 function and is known to be a precaution against genotoxic agents. In this study; The effects of the pifithrin-apla molecule on HSC cells were investigated. For this purpose, mouse HSCs were enriched by magnetic line abstraction. Human umbilical cord blood (UCB) and osseous (BM) mononuclear cells were isolated by histopak intensity gradient centrifugation. When the cells were cultured under appropriate conditions with the prepared HSC media, DMSO treatment was used as a control. After seven days of incubation with the small molecule of pifithrin-apla, mouse HSCs were analyzed for lin (-), sca1, c-kit, MD34 markers. Likewise, for human HSCs, CD34 and CD133 markers were analyzed. Cell line analysis and apoptosis analysis were performed following incubation of FACS-purified mouse LSK cells with the selected optimal dose molecule. At the same time, the effects of Human Umbilical Venous Endothelial Cells (HUVEC) and Human Dermal Fibroblast (HDF) and fat tissue on MSCs were also examined and did not have a negative effect. The small molecule of pifithrin-alpha caused a 3-fold increase in LSK (lin-sca1 + c-kit +) and human UCB HSC cells. Similarly, human BM caused a 2-fold increase in HSC cells. At the same time, chicken HSC was isolated and surface marker secreening was performed. So; Avian influenza and the effects of human HSCs. As a result, it is thought that this molecule can be used to increase ex vivo HSC expansion and treatment efficacy.