Multi-gene regulation using DNA-origami-AuNPs nanostructures in breast cancer cells

Abstract

Gen anlatımının düzenlenmesi, genetik temelli olan hastalıkların tedavisinde özgün bir yol olarak görülmektedir. Bu sebeple gen taşınması ve düzenlenmesinin verimini artırmak amacıyla yoğun olarak çalışmalar yürütülmektedir. Bu tez çalışmasında hâlihazırda var olan taşıma sistemlerine alternatif olarak morfolino antisens oligonükleotidlerinin gömülü olduğu DNA tabanlı bir nanoyapı oluşturulmuştur. Karo şeklinde tasarlanan DNA origami yapısı hazırlanarak hücre içi alımı artırmak amacıyla altın nanopartiküller ile modifiye edilmiş ve meme kanseri hücrelerinde oldukça yüksek anlatımı bulunan HER2, ERα, EGFR ve Ki-67 genlerinin baskılanmasında kullanılmıştır. Hazırlanan yapı agaroz jel elektroforezi, AFM, DLS ve UV/Vis spekroskopi teknikleri kullanılarak karakterize edilmiştir. Stabilite ve toksisite analizlerinin ardından nano yapı bahsi geçen genlerin bu genler bakımından yüksek anlatıma sahip olan meme kanseri hücre hatlarında susturulması amacı ile kullanılmıştır. Morfolino gömülü DNA origami-AuNPs nanoyapılarının tekli ve çoklu gen susturmada etkin yapılar oldukları belilenmiştir. 30 nM morfolino konsantrasyonunda hedef gen anlatımını yüzde 50 oranında baskıladığı gösterilmiştir. Çoklu gen susturma çalışmaları kapsamında birden fazla morfolino oligosu yapıya gömülmüş ve gen susturma veriminin sinerjitik etki ile yüzde 80'e yükseldiği belirlenmiştir. Hedef genlerin tekli ve çoklu düzenlenmesinin ardından gen susturmanın kanser hücre çoğalması ve hücre döngüsü fazları üzerindeki etkileri araştırılmıştır. DNA origami-AuNPs kullanılarak gerçekleştirilen gen susturmanın kanser hücre çoğalmasını baskıladığı ve hücre döngüsünde farklılıklara yol açtığı belirlenmiştir. DNA origami-AuNPs nanoyapılarının susturma verimliliği ticari transfeksiyon ajanlarının verimlilikleri ile kıyaslanmış ve hazırlanan yapının daha etkili olduğu gösterilmiştir. Diğer yandan DNA origami-AuNPs nanoyapıları kanserli ve sağlıklı hücreler üzerinde herhangi bir toksik etki göstermezken test edilen ticari ajanların hücre canlılıklarını etkiledikleri görülmüştür. Hazırlanan nanoyapının gen düzenlenmesi çalışmaları için etkili ve biyouyumlu bir taşıyıcı system olduğu görülmektedir.

Gene regulation is a novel approach to cure a gene related disease. Thus, there is an ongoing effort to increase the efficiency of gene delivery. In this thesis, we developed a DNA based nanostructure to deliver gene regulation elements for the up-regulated genes in breast cancer as alternative to the currently used non-viral delivery systems. A tile shaped DNA origami nanostructure is constructed by including morpholino antisense oligonucleotides targeting the HER2, ERα, EGFR, and Ki-67 genes. Then, the sticky ends of the DNA origami nanostructures were hybridized to the complementary oligonucleotide sequence attached to gold nanoparticles (AuNPs) to enhance their cellular uptake. The constructed nanostructure was characterized using agarose gel electrophoresis, AFM, DLS and UV/Vis spectroscopy. Following the stability and toxicity analysis of the structure, the nanocarrier system was used for silencing of the mentioned genes in their overexpressing breast cancer cell lines. It was found that the antisense oligonucleotide embedded DNA origami-AuNPs structure was highly effective for inducing single and multiple-gene silencing in breast cancer cells. The prepared nanocarrier inhibited the expression of target genes approximately 50 per cent at 30 nM morpholino concentration. For multi-gene silencing, more than one morpholino oligos targeting different genes were embedded into DNA nanocarrier and the silencing efficiency increased to about 80 per cent by synergistic effect. After silencing of the target genes alone and in combination, the effects of the gene regulation on breast cancer cell proliferation and cell cycle phase distributions were investigated. It was showed that gene silencing using DNA origami-AuNPs nanostructures inhibited proliferation of the breast cancer cells and altered their cell cycle phase distributions. Silencing efficiency of DNA origami-AuNPs nanostructures was compared with commercial transfection agents and found to be more effective. Furthermore, DNA origami-AuNPs nanostructures did not affect viability of cancer and healthy cells, while the tested commercial systems were highly toxic. The proposed novel nanostructure provides an effective and biocompatible carrier for gene silencing studies.