Characterization of innate and adaptive immune responses of two rare primary immune deficiencies: CTPS1 and CD55

Abstract

Immün sistemde kalıtsal olarak bulunan mutasyonların sonucunda ortaya çıkan hastalıklar, Primer İmmün Yetmezlik (PİY) olarak bilinmektedir. Yaklaşık 350'den fazla PİY tespit edilmiş olmasına rağmen, her geçen gün yeni PİY vakaları tanımlanarak bu liste büyümektedir. PİY'ler, immün sistemi etkiledikleri alanlara göre iki farklı kategoriye ayrılır: Doğal ve edinsel bağışıklık immün yetmezlikleri. Bundan dolayı, her bir immün yetmezlik çeşidinin semptomları birbirinden farklıdır. Bunu göz önünde bulundurarak, PİY üzerine yapılan çalışmalar, immün sistemin nasıl çalıştığını göstermede önemli rol oynamaktadır. Bu çalışmada, iki adet nadir görülen monogenik eksikliğin immün yanıtlarını araştırdık. CTPS1 eksikliği edinsel bağışıklık yetmezliklerinin, CD55 eksikliği ise doğuştan gelen immün yetmezliklerinin en yeni örneklerindendir. CTPS1, sitidin trifosfat (CTP) de novo üretimin yolağında yer alan enzimlerden biridir ve eksikliği lenfositlerin çoğalmasını etkilediği bilinen bir PIY'dir. Fakat, bu hastalığın diğer immün parametreleri nasıl etkilediği hâlâ tam olarak bilinmemektedir. Hastaların viral enfeksiyona yatkınlığı sebebiyle, ilk olarak hastadan izole edilen sitotoksik T-hücrelerin STAT1 fosforlanma seviyelerini ve etkinleşme yüzey belirteç miktarını akan hücre ölçer ile tespit ettik. STAT1 fosforlanma düzeyi sağlıklı bireylerle aynı düzeyde seyretse de sitotoksik hücrelerin yüzeyinde ifade edilen etkinleşme belirteçlerinin hastada arttığını bulduk. Bunun üzerine, CD4+ T-hücrelerinin farklılaşmasında önemli rol oynayan sitokinlerin etkisini araştırdık. CD4+ T-hücrelerinin sağlıklı bireylere oranla daha düşük düzeyde STAT3 ve STAT5 fosforlanması gerçekleştirebildiğini tespit ettik. Sonrasında, yardımcı T-hücrelerinden üretilen sitokin seviyelerini inceledik. Sonuçlar, IL-17a ve IL-10 sitokinlerinin seviyelerinin de sağlıklılara kıyasla azalmış, Th1 ve Th2 yanıtlarının ise benzer seviyelerde olduğunu göstermiştir. Ayrıca, TLR3, TLR7 ve TLR9 almaçları uyarıldıklarında CTPS1 periferik mononükleer hücreleri (PMBCs) tarafından üretilen IFN-gamma yanıtlarının sağlıklılara göre benzer seviyede olduğunu bulduk. Bunun yanı sıra, hasta PBMC'lerinin TLR7 ve IFI16-STING yolakları uyarıldığında, tip iki IFN yanıtlarının az miktarda azaldığını elde ettik. Bu yolakların uyarımı sonucunda üretilen IL-12 yanıtlarının normal seviyelerde olduğunu bulduk. Bu sonuçlar bize, azalmış IFN-gamma yanıtlarının doğal bağışıklık sisteminin düzgün fonksiyon gösterememesinden ya da anormal APC yanıtlarından kaynaklanmadığını göstermiş oldu. Beklenmedik şekilde, hastanın PBMC'lerinde yüksek miktarda granüllü hücrelerin bulunduğunu gözlemleyince, akan hücre ölçer ile yaptığımız incelemeler bu hücrelerin CD14- CD15+ ifade eden düşük yoğunluklu granülositler olduğunu belirledik. Bu bulgu bizi, hastanın nötrofillerinin NETotik eğilimlerini araştırmaya itti. Mikroskopik ve spektroflorometrik incelemeler bize CTPS1 eksikliği bulunan hasta nötrofilerinin spontan NETosiz gerçekleştirdiğini gösterdi. Bu tezin ikinci kısmında, CD55 eksikliği bulunan hastaların PBMC'leri üzerine çalışmalar yaptık. CD55, kompleman yolağında bulunan bir düzenleyici proteindir. Bu protein, klasik ve alternatif kompleman yolaklarında bulunan C3 Konvertaz'ın etkinliğini düzenlemektedir. Bunun doğal sonucu olarak, CD55 eksikliği bulunan hastalarda anormal düzeyde kompleman etkinleşmesi gerçekleşmektedir. Bununla beraber, hastalarda şiddetli karın iltihabı, sık enfeksiyonlar ve besin kaybı sonucu gerçekleşen yetersiz beslenme ve büyüme bozukluğu görülmektedir. Hastalardaki yüksek miktarda seyreden C5a aktif protein seviyelerinin azaltılması amacıyla, Eculizumab adlı ilaç hastalara verilmeye başlanmıştır. Bu nedenle bu çalışmamızda, CD55 eksikliğinin PRR-kompleman çapraz konuşması ve tekrarlayan enfeksiyonlar üzerindeki etkisini araştırmayı amaçladık. Bununla beraber, Eculizumab terapisinin immün sistemin üzerine olan etkisini de araştırdık. Dört hastanın PBCM'leri tek doz Eculizumab i) terapisi öncesi (BT) ve ii) terapisi sonrası (AT) izole edildi. BT PBMC'leri, endozomal TLR (TLR3, TLR7 ve TLR9) ve hücre içi nükleik asit sensör (STING, DAI, RIG-I & MAVS) yolakları uyarıldığında, sağlıklılara oranla anlamlı derecede düşük seviyelerde IFN-alfa ve IP-10 üretirlerken, Eculizumab terapisinin, doğal bağışıklık yanıtlarındaki bozukluğu geri döndürmeye yeterli olmadığını bulduk. Aynı almaçlar uyarılıp BT ve AT PBMC'lerinden üretilen TNF-alfa, ve IL-6 sitokin miktarları da tayin edildi. Sonuçlar bize sadece IL-6 sitokininin sağlıklılarla karşılaştırıldığında anlamlı derecede düşük seviyelerde üretildiğini gösterdi. CD55 eksikliği bulunan hastalarının hücre dışı keseciklerinin (EVs), immün sistem üzerine etkisini Eculizumab terapisi öncesinde ve sonrasında inceledik. Sonuçlar bize, AT EV'lerinin, CD55 hastalarının PBMC'leri ile beraber bekletilmesi sonucunda, BT EV'lere oranla daha düşük seviyede TNF-alfa, IL-1alfa and IFN-alfa ürettirdiklerini gösterdi. Aynı zamanda AT EV'lerinin PBMC'lerden üretilen IL-10 miktarını artırdığını de tespit ettik. Son olarak, BT ve AT EV'leri, sağlıklı bireylerden izole edilen PBMC'lerle inkübe edildiğinde, BT EV'lerin, PBMC'lere daha fazla IP-10 salgılattığını tespit ettik. Bütün bu sonuçlar birlikte ele alındığında, EV'lerin, PIY'lerin hastalık sürecine katkıda bulunabileceğini önermektedir.

Primary Immune deficiencies (PIDs) are disorders of immune system caused by mutated genes. There are approximately 350 different disorders and each day novel ones are being defined. They can be categorized based on part of immune system harboring mutation; that is, they can be divided into disorders of innate and adaptive immune system. Each of them represents itself distinctly. In that perspective, studies based on characterization of PIDs enable us to comprehend how immune system works. Herein, we characterized innate and adaptive immune responses of two rare immune deficiencies: CTPS1 and CD55 which are novel examples of disorders of adaptive and innate immune system, respectively. CTPS1 is an enzyme functioning in de novo synthesis of nucleotide, CTP. Defective CTPS1 enzyme impairs lymphocytes to proliferate, however, other aspects of this deficiency still remain elusive. Since patients are prone to viral infections, we first explored functionality of cytotoxic T-cells through assessing STAT1 phosphorylation levels and expression of activation markers. Even though flow cytometry analyses revealed that CTPS1 deficient CD8+ T-cells had normal phospho-STAT1 levels, degranulation marker confined to surface of CD8+ T-cells were found to be elevated. Next, we investigated CD4+ T-cells with cytokines that are crucial for differentiation and fate. We detected that patient CD4+ T-cells had low phospho-STAT3 and phospho-STAT5 levels. Then, we checked the cytokine production profiles of CD4+ T-cells. Data indicated that percentages of IL-17a and IL-10 secreting cells are reduced in patient whereas Th1 and Th2 signatures were similar to healthy controls. Moreover, IFN-gamma levels of PBMCs upon TLR3, TLR7 and TLR9 ligand stimulations were found to be similar to healthy responses. Notably, patient had slightly reduced TLR7 and IFI16-STING mediated type II IFN secretion. We further showed that CTPS1 PBMCs had normal IL-12 levels, implying that the reduction in IFN-gamma was not due to either dysfunction of innate immune cells or by aberrant APC function. Surprisingly, patient PBMCs had higher number of granulocytes and flow cytometry analyses revealed that these granulocytes were CD14- CD15+ low-density granulocytes. This prompted us to assess the NETotic tendencies of CTPS1 neutrophils and we observed via microscopic and spectrofluorometric investigations that they underwent spontaneous NETosis. In the second part of this study, we worked with CD55 deficient patient PBMCs. CD55 is a complement regulatory protein and it inhibits formation of C3-convertase in classical and alternative complement pathways. Thus, patients suffer from aberrant complement activation in its absence as well as severe bowel inflammation and recurrent infections along with nutrient loss leading to malnutrition and growth deprivation. Eculizumab therapy was initiated to these patients in order to neutralize their pathologic C5 levels. We attempted to investigate effect of CD55 deficiency on PRR-complement cross-talk, recurrent infections and checked the contribution of Eculizumab therapy to their immune status. PBMCs of 4 patients, i) before (BT) and ii) after (AT) a single dose of Eculizumab administration were isolated. BT PBMCs had significantly reduced IFN-alpha and IP-10 secretions upon endosomal (TLR3, TLR7 and TLR9) TLRs and nucleic acid sensors (STING, DAI, RIG-I & MAVS) stimulations. Moreover, single Eculizumab therapy did not alter this innate immune dysfunction. Furthermore, we assessed levels of TNF-alpha, IL-6 productions from PBMCs stimulated with same ligands and observed that IL-6 but not TNF-alpha was reduced after PRR stimulations. Next, immunomodulatory effects of CD55 EVs before and after Eculizumab therapy was sought. ELISA results demonstrated that AT EV incubation on CD55-/- PBMCs lead to reduced TNF-alpha, IL-1alpha and IFN-alpha production. Meanwhile, AT EVs increased IL-10 production from patient PBMCs. Lastly, we assessed cytokine levels after healthy PBMCs were incubated with BT and AT EVs and found that PBMCs that incubated with BT EVs had elevated levels of IP-10 cytokine. When taken together, progression of PIDs might have been contributed by extracellular vesicles.