H-ras aktif hücrelerinin Fibronektin proteinine bağlanma yeteneklerinin incelenmesi

Abstract

Ras proteini, aktif olduğu hücrelerde sinyal iletimi yollarının düzenlenmesinde, hücre büyümesi ve farklılaşmasında merkezi bir moleküldür. Ras uyarıcı döngünün aktifleşmesinin, çeşitli kanserlerin ilerlemesinde önemli bir etken olduğu bulunmuştur.Fibronektin, ekstraselüler matriksin glikoprotein ailesine ait yüksek moleküler kütleli bir proteinidir, hücre zarındaki spesifik integrin moleküllerine bağlanır. Fibronektin, hücre gelişimi, hücre farklılaşması, doku oluşumu, apoptoz gibi birçok hücresel olayda önemli etkiye sahiptir.Bu çalışmada, H-ras aktif sıçan embriyo fibroblast hücreleri (5RP7)'nin çoğalma oranının zamana bağlı olarak belirlenmesi, bu hücrelerin fibronektin proteinine bağlanma kapasitelerinin ve bu bağlanmanın hücre apoptozu üzerine etkilerinin belirlenmesi amaçlanmıştır.5RP7 hücrelerinin büyüme eğrisinin belirlenmesi için tripan mavisi ile boyama yöntemi, bu hücrelerin fibronektine bağlanma kapasitesinin belirlenmesi için MTT yöntemi kullanılmış, değişik konsantrasyonlardaki fibronektin'e bağlı hücrelerin apoptozunda kaspaz enzim aktivitesinin belirlenmesi için DNA parçalanma oranları ölçülmüştür.5RP7 hücre konsantrasyonları zamana bağlı olarak doğru orantılı artış göstermiştir, etki çalışmalarında kullanılmak üzere optimum hücre sayısı 12,5x104 olarak tespit edilmiştir. 5RP7 hücrelerinin fibronektin'e bağlanmalarının konsantrasyona bağlı değişim gösterdiği ve hücrelerin 30 ?g/ml fibronektin'e maksimal oranda bağlandığı gösterilmiştir. Buna karşın, 30 ?g/ml fibronektin'e bağlanan hücrelerin apoptoza gitmediği, 10 ?g/ml fibronektin'e bağlanan 5RP7 hücrelerininse apoptoza giderek apoptotik DNA belirteci görüntüsüne paralel görüntü verdiği gösterilmiştir. Kaspaz-3 ve kaspaz-9'un fibronektin'e bağlı 5RP7 hücre apoptozu üzerindeki etkileri bu enzimlere spesifik inhibitörlerin eklenmesiyle araştırılmıştır. Kaspaz-3 ve kaspaz-9 inhibisyonunun fibronektin'e bağlı 5RP7 hücre DNA parçalanma oranını azalttığı belirlenmiştir. Sonuç olarak 5RP7 hücrelerinin fibronektin'e bağlı apoptoz mekanizmasının, mitokondrial yolaktan ya da endoplazmik retukuluma bağlı [Ca]+2 artışı sonucunda kaspaz-12 ve daha sonra kaspaz-9'un aktivasyonuna bağlı olduğu düşünülmektedir.

Ras protein regulates cell signaling, proliferation and differentiation. Its expression increases in embriogenesis, healing of wounds and mitosis.Fibronectin, an extracellular matrix glycoprotein with a high molecular weight, binds to the specific integrin molecules on the cell membrane and plays an important role in many cellular activities, such as cell growth, tissue formation and apoptosis.In this study, rat embrio fibroblast cells (5PR7) were used. Growth curve of them was investigated by using trypan blue dying method. The adhesion capacity of 5RP7 to fibronectin was determined by adhesion assay (MTT). DNA fragmentation was used to determine the role of caspase enzymes in apoptosis in different concentrations of fibronectin.The growth rate of 5RP7 cells was found time concentration-dependent and the optimum number of cells for further studies is determined as 12.5x104. The cells adhered to 30 ?g/ml fibronectin maximally. They did not undergo apoptosis. The 5RP7 cells which adhered to 10 ?g/ml fibronectin underwent apoptosis and their appearance was similar to that of apoptotic DNA markers.Effects of caspase-3 and caspase-9 on apoptosis of 5RP7 cells that adhered to fibronectin were studied by addition of specific inhibitors of these enzymes. It is found that inhibition of these enzymes reduces the rate of DNA fragmentation in these cells. It is found that their apoptosis mechanism depends on the increase in the caspase-12 and then caspase-9 activities triggered by mitochondrial pathway or increase in [Ca]+2 that adhered to endoplasmic reticulum.