İnsan serumundan paraoksonaz 1 izoenziminin saflaştırılması ve bazı bitki ekstrelerinin enzim aktivitesi üzerine etkilerinin incelenmesi

Abstract

Paraoksonaz 1 (E.C.3.1.8.1; PON1) metabolizmada önemli bir organofosfat hidrolizleyicisi olarak görev yapan ve yapısında 2 adet Ca2+ bulunduran HDL bağımlı bir metaloenzimdir. Enzim HDL'yi oksidasyondan koruduğu gibi LDL'yi de koruyarak aterosklerotik lezyonların oluşumunu engelleyen hayati bir öneme sahiptir. Tez çalışması kapsamında Crataegus tanacetifolia, Rumex acetosella, Thymus sibthorpii ve Asphodeline taurica bitkilerinden hazırlanan ekstrelerin antioksidan özellikleri belirlendi. Bitki ekstrelerinin antioksidan kapasitelerini belirlemek için; demir indirgeme, FRAP, CUPRAC, ABTS, DPPH, DMPD, bipiridil, süperoksit anyon radikali giderme, total fenolik bileşik miktar tayini ve total antioksidan aktivite tayini yöntemleri uygulandı. Aynı zamanda LC/MS-IT-TOF yöntemiyle bitki ekstrelerinin moleküler içeriği tespit edilerek belirlenen etken maddelerle PON1 izoenziminin muhtemel etkileşimleri in silico çalışmalar ile gösterildi. Daha sonra PON1 izoenzimi, insan serumundan sırasıyla, amonyum sülfat çöktürmesi, DEAE-Sephadex A-50 iyon değişim ve Sephadex G-100 jel filtrasyon kromatografisi kullanılarak %5,49 verimle saflaştırıldı. Saflaştırma katsayısı yaklaşık 79,54 ve spesifik aktivitesi 2612,22 EU/mg protein olarak hesaplandı. PON1 izoenziminin saflığı SDS-PAGE yöntemi ile kontrol edilerek alt birim molekül kütlesi 43 kDa olarak belirlendi. Bitki ekstrelerinin enzimin paraoksonaz aktivitesi üzerine in vitro etkileri Aktivite (%) – [Ekstre] grafiklerinde gösterildi. En yüksek aktivite değerini Rumex acetosella bitkisinin etanollü ekstresi, en düşük aktivite değerini ise Asphodeline taurica'nın sulu ekstresi gösterdi. Son olarak kullandığımız bitki ekstrelerinin mitokondriyal aktivite testi (MTT) ile sitotoksisite düzeyleri hesaplandı.Anahtar Sözcükler: Paraoksonaz 1, Enzim saflaştırma, Enzim aktivitesi, Docking, Antioksidan aktivite, MTT

Paraoxonase 1 (E.C.3.1.8.1; PON1) is a 2 Ca2+ -studded HDL dependant metaloenzyme that acting as a crucial organophosphate hydrolyzer in metabolism. Enzyme prevents HDL from oxidation. Morever, enzyme protects LDL and has a vital role of inhibition of atherosclerosis legions.As a part of thesis, antioxidant activity of extracts from Crataegus tanacetifolia, Rumex acetosella, Thymus sibthorpii ve Asphodeline taurica were determined via ferrous reduction, FRAP, CUPRAC, ABTS, DPPH, DMPD, bipyridyl, superoxide anion radical scavenging, total phenolic compounds and total antioxidant activity methods. Then, major compounds of plant extracts were identified via LC/MS-IT-TOF and possible interactions with PON1 isoenzyme were demonstrated in silico studies. Furthermore, PON1 isoenyzme was purified with 5.49% yield from human serum using a method in order to ammonium sulphate precipitation, DEAE-Sephadex A-50 ion exchange and Sephadex G-100 gel filtration chromatography. Purification factor and specific activity were calculated as 79.54 and 2612.22 EU/mg protein, respectively. Purity of PON1 isoenzyme was tested using SDS-PAGE and also subunit molecular weight was determined as 43 kDa. In vitro effects of extracts to paraoxonase activity was presented in Activity (%) – [Extract] graphs. The highest activity value was attained from ethanol extact of Rumex acetosella, and on the contrary the lowest activity value from aqueous extract of Asphodeline taurica. In conclusion, cytotoxicity of extracts was investigated with Mitochondrial Activity Test (MTT).Keywords: Paraoxonase 1, Enzyme purification, enzyme activity, docking, antioxidant activity, MTT