Design and application of compartmentalized platforms for neurobiological research

Abstract

Nörobiolojik Araştırmalar İçin Kompartmentalize Mikrofluidik KültürPlatformu Tasarım ve TatbikatıAlışılagelmiş hücre kültürleri; aksonları uzun mesafeler katedip, değişkenmikroçevresel alanlarda bulunan periferik nöronların dejenerasyon ve rejenerasyonununkapsamlı bir şekilde incelenmesi için yeterli olmamaktadır. Bu sebeple, akson zedelenmesi,rejenerasyon ve sinir nakli gibi değişik biçimlere uyarlanabilecek bir in vitro sistemeihtiyaç vardır. Bu amaçla sinir hücrelerinin bir kompartmanda yetiştirilip, aksonlarınıaradaki mikrokanallar vasıtası ile diğerine uzatabildiği fluidik olarak izole ikikompartmandan oluşan yenilikçi bir in vitro hücre kültür platformu tasarlanmış veuygulaması yapılmıştır. Dolayısı ile lokal mikroçevre manipülasyonu sayesinde aksondejenerasyonunun daha detaylı idrakı ve koruyucu ve nörotropik ajanların periferikaksonlar üzerinde yerel etkilerinin belirlenmesi mümkün olmuştur.Öncelikle 'glial hücre hattı türevli büyüme faktörü ligand ailesi'nin rejeneratifetkileri bir mikrofluidik akson kopması modelinde incelendi ve aksonların ortama eklenenGDNF'le en yüksek büyümeye ulaştıkları belirlendi. Bu sonuçlar büyüme faktörüne dayalıperiferik akson yenilenme tedavilerine katkı sağlayacaktır. Daha sonra ilaç tarama içinaxon uçlarındaki dejenerasyonu in vitro modelleyebilen ve bu alanda ilk olan yüksekverimli kompartmentalize platform geliştirildi. Bu platform, Paclitaxel kaynaklı periferiknöropati'lere karşı akson koruyucu ajanlar bulabilmek amacı ile ilaç taramasındakullanıldı. Flucinolone Acetonide (FA) in vitro analizlerde sinir koruyucu ajan olaraktanimlandi ve paclitaxel kaynaklı periferik nöropatilere karşı aksonları dejenerasyona karşıkoruma özelliği in vivo nöropati modelinde ispatlandı. FA Paclitaxel'den önce veya beraberverilerek akson dejenerasyonu başlamadan önlenmesi sağlandı. Son olarak; izole in vivoortamları andıran kompartmentalize mikrofluidik platformlar, sinir hasarlarının tedavisindekullanılan kök hücre replasman tedavilerinin in vitro modellemesi için kullanıldı ve fareembriyonik kök hücreden türeyen oligodendrisitlerin yine fare embriyonik kök hücredentüreyen motor nöronların aksonlarını myelinle kaplayabileceği gösterildi.Anahtar Sozcükler: Kompartmentalize mikrofluidik platform, Kemoterapi kaynaklıperiferik nöropati, Paclitaxel, Taxol, Fluocinolone Acetonide, yüksek verimli ilaç taramasistemi, myelinizasyon, fare embriyonik kök hücre türevli motor nöron, fare embriyonikkök hücre türevli oligodendrosit.

Design And Application of Compartmentalized Platforms forNeurobiological ResearchConventional culture systems remain inadequate for comprehensive understandingof injury and regeneration in peripheral neurons that extend axons over long distances andthrough varying extracellular microenvironments. Therefore, a highly tailorable in vitrosystem, that allows studying in different in vitro models that mimics axonal injury,regeneration and nerve transplants is required. This dissertation presents the developmentand application of novel compartmentalized in vitro cell culture platforms, where cellbodies are cultured on one side and axons are allowed to grow to the other side throughmicrochannels that connect the two fluidically isolated compartments. These devicesenable the manipulation of local environments and a more complete understanding ofaxonal degeneration and localized and site of action of toxic, neuroprotective, andneurotropic effects of agents in peripheral axons.First, regenerative effects of members of the glial cell-line derived nerve growthfactor (GDNF) family of ligands (GFLs) were investigated in a microfluidic physical injurymodel and GDNF was most potent in promoting axon outgrowth after axotomy. Next, thefirst high throughput compartmentalized microfluidic platform (HTCMP) is developed,which is an innovative model for in vitro assays in drug screening, where distal axonaldegeneration can be modeled by manipulating compartments independently. HTCMP istested and implemented in drug screening, in order to identify therapeutic candidates foraxonal protection from Paclitaxel induced peripheral neuropathy (PIPN). FlucinoloneAcetonide (FA) is identified as a neuroprotective compound in vitro and validated in vivothat it demonstrates axonal protection from PIPN as well as relieving neuropathic pain. FAcan be co- or pre administered before the injury to peripheral axons takes place, so thatPIPN may be prevented. Finally, compartmentalized microfluidic platforms that mimics theisolated in vivo environment, are used in an in vitro model of stem cell replacement therapyfor nerve injuries, and it is demonstrated that that the axons of mESC (mouse embryonicstem cell) derived motor neurons are myelinated by mESC derived oligodendrocytes.Keywords: compartmentalized microfluidic culture platform, chemotherapyinduced peripheral neuropathy, Paclitaxel, GDNF, Flucinolone Acetonide, highthroughput drug screening, myelination; embryonic stem cells (ESCs); mouseESCs derived motor neurons; mouse ESCs derived oligodendrocytes.