Developing artificial corneal endothelium micro-environment using bioinspired approach

Abstract

Bu tez çalışmasında, kornea endotelyumun altında bulunan tabakanın sertliğive kimyasal yapısı taklit edilerek ve endotelyumun topografisinden esinlenilerek sağlıklıkornea endotelyumu mikroçevresi hazırlanmıştır. Descemet membranın 20 ila 80 kPasertlik aralığında poliakrilamid hücre substratları sentezlenmiştir. Kornea endotelyumhücrelerinin çoğunlukla altıgen olan 20um çapında ve 4um derinliğinde şekillerindenesinlenilerek silikon kalıplar üzerinde fotolitografi tekniğiyle altıgen desenlerolusturulmuş ve bu desenler yumuşak litografi yöntemiyle substratlara aktarılmıştır.Üzerlerinde altıgen desenler bulunan PAAm hidrojeller endotelyumun mikroçevresinibiyokimyasal olarak da taklit edebilmek için tip 4 kolajen, hyaluronik asit, tip 4 kolajenve hyaluronik asit karışımlarının farklı oranlarıyla modifiye edilmiştir. Kimyasalmodifikasyonlar Fourier Dönüsümlü Infrared Spektrofotometre (FTIR), Su Temas AçısıÖlçümleri (WCA) ve Immunofloresans görüntüleme yöntemleriyle doğrulanmıştır. Karakterizasyonaşamasından sonra, kornea endotelyum hücrelerinin hazırlanan bu substratlarüzerinde tutunması, canlılığı ve morfolojileri incelenmiştir. Hücre kültürü çalışmalarınınsonuçları substratların yüzey topografilerinin hücre morfolojisini değiştirmeklebirlikte canlılığı önemli ölçüde arttırdığını göstermiştir. Buna ek olarak, substratyüzeyinin kimyasal bileşiminin hücre tabakası oluşturulmasında önemli bir parametreolduğu gösterilmiştir. Bu sonuçlar, kornea iyileştirilmesinde hücre tabakalarının klinikuygulamalarında biyotaklit ve biyoesinlenmiş stratejilerin kullanılabileceğini göstermektedir.

In this thesis, micro-environment of healthy corneal endothelium was preparedby mimicking the stiffness and chemistry of underlying layer of endothelium, and inspiringfrom topography of corneal endothelium. Polyacrylamide (PAAm) hydrogel cellsubstrates were synthesized with in the stiffness range of Descemet's membrane's elasticmodulus value of 20-80 kPa. Hexagonal patterns with dimensions 20m in diameterand 4m in depth which inspired from mostly hexagonally shaped corneal endothelialcells (CECs) were created on silicon wafer mold via photolithography and transferredto PAAm hydrogels by using soft lithography technique. PAAm hydrogels which havehexagonal patterns were modified with Collagen IV (Col IV), hyaluronic acid (HA)and different amount mixtures of Col IV and HA to mimic corneal endothelium biochemicallyas well. Chemical modifications were confirmed with Fourier TransformInfrared Spectroscopy (FTIR), Water Contact Angle (WCA) Measurements and Immunofluorescenceimaging. After characterization, adhesion, viability and morphologyof corneal endothelial cells on these substrates were investigated. The results of cellculture studies indicate that surface topography of substrates enhances cell viabilitysignificantly while altering cell morphology. Moreover chemical composition of substratesurface was shown to be an important parameter for growing cell sheets. Theseresults provide a proof of concept for biomimetic and bioinspired strategies for cornealrecovery through clinical translations of cell sheet growth approaches.