Fenilketonüri ve kistik fibrozis kalıtsal hastalıklarında kodlayıcı bölge mutasyonlarını taramak için SSCP yönteminin kullanılması

Abstract

ÖZET İnsan genomunun şifresi her geçen gün biraz daha çözümlenmektedir. Hastalık patolojilerinde rol oynadığı bilinen genler izole edildikçe, hastalığa sebep olan mutasyonların taranmasında kullanılabilecek hızlı, ucuz ve kolay tekniklere olan ihtiyaç da artmaktadır. Tek zincir konformasyon polimorfizm (SSCP) analizi bu amaçla geliştirilmiş teknikler arasında en çok kullanılan tekniklerden biridir. Büyük bir gen, SSCP kullanılarak, bilinen ve bilinmeyen mutasyonlar açısından taranabilir. SSCP tekniği hızlı, kolay uygulanabilir ve ucuz olması ile radyoaktif olmayan bir teknik olarak da kullanılabilmesi açısından avantajlıdır. Kistik fibrozis (KF) ve fenilketonüri, Türk populasyonunda en sık görülen kalıtsal hastalıklardan ikisi olup, yüksek genetik heterojeniteye sahiptirler. Bu nedenle, genotipleri önceden belirlenmiş hastalardan elde edilen DNA örnekleri kullanılarak gümüş boyama yöntemi ile PCR (Polimeraz Zincir Reaksiyonu), SSCP analizi laboratuvar şartlarına göre optimize edildi. Çalışmamızda fenilketonüri için R261Q ve IVS10 mutasyonlarmı taşıyan 4, kistik fibrozis için AF508 ve ATA mutasyonlarını taşıyan 5 olgu olmak üzere heterozigot, homozigot ve normal genotipe sahip birer bireyin örnekleri çalışıldı. Farklı koşulların denenmesi sonucunda PAH(Fenilalanin Hidroksilaz) geninin 7.eksonunda bulunan R261Q mutasyonu için, % 5 gliserol içeren % 10'luk (39:1 akrilamid:bisakrilamid oranıyla) jelde 600 V sabit voltaj farkında oda ısısında 5.5 saat yürütüldüğünde, aynı genin 10. intronunda bulunan IVS10 mutasyonu için ise aynı şartlarda fakat 79:1 oranında akrilamid:bisakrilamid bulunduran SSCP jelinde yürütüldüğünde bant kayması en iyi saptandı. KF hastalığına sebep olan CFTR (Kistik Fibrozis Transmembran Regülatör) geni 10. eksonunda bulunan AF508 ve ATA mutasyonları için ise, en iyi sonuç 39:1 oranında akrilamid:bisakrilamid bulunduran % 10'luk jelde % 5 gliserol oranı +4 ° C'de 750 V sabit voltaj farkı olarak belirlendi. Anahtar Kelimeler :Kistik Fibrozis, Fenilketonüri, Tek Zincir Konformasyon Polimorfizmi Analizi IV

ABSTRACT The human genomic code is being dissolved day by day. As many genes known to play a role in the pathology of the diseases are isolated, the need for the fast, cheap and easy techniques increases. Among the techniques developed for that purpose, Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP) analysis is one of the most widely used technique. By using SSCP analysis, a long gene can be screened for known or unknown mutations. SSCP technique has the advantages of being fast, easy and relatively unexpensive and it could be used non-radioactively. Cystic fibrosis and phenylketonuria are the diseases, which are the most common, and has a high genetic heterogeneity in Turkish population. For that reason, we optimized the PCR(Polymerase Chain Reaction)-SSCP analysis for our laboratory conditions with the use of silver staining procedure, using DNA samples of patients whose genotypes are previously determined. Samples of total number of 4 patients for R261Q and IVS10 mutations of phenylketonuria and 5 patients for AF508 and ATA mutations of cystic fibrosis having heterozygote, homozygote and one normal genotype for each were studied. SSCP analysis has been run under different conditions. For R261Q mutation located on the exon 7 of PAH (Phenylalanin Hydroxylase) gene, band shift were obtained best from SSCP jels containing 5 % glyserol, 10 % polyacrylamide (with the ratio of 39:1 acrylamide: bisacrylamide) run under 600 V constant voltage at room temperature. Best results of SSCP analysis for IVS10 mutation found on the intron 10 of the same gene has been obtained under the same conditions but with the acrylamide to bisacrylamide ratio of 79:1. For the AF508 and ATA mutations which are found on the exon 10 of the CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator) gene which causes cystic fibrosis, the best results has been obtained from the SSCP jels of containing 10 % polyacrylamide (with the acrylamide: bisacrylamide ratio of 39:1) 5 % glyserol, run at +4 °C with 750 V constant voltage. Key Words :Cystic Fibrosis, Phenylketonuria, Single Strand Conformation Polymorphism Analysis