İnsan uterus damar endotelinde FAS antijen (CD95) ve fas ligand (FasL, CD95L) ekspresyonlarının regülasyonu

Abstract

ÖZET İnsan uterusu yaşam boyunca hem hücresel hem de moleküler seviyede önemli değişimlere gider. Bu bağlamda, insan vücudundaki bir çok fizyolojik ve patalojik olayın araştırılması ve anlaşılması için uterus bir rehber doku olma özelliği taşımaktadır. İlaveten endometriyum endotel hücreleri bir çok bakımdan endometriyumdaki olayarm merkezinde yer alan hücrelerden en önemlilerinden bir tanesidir. Fas-FasL sitemi apoptozun sinyalinin başlamasında oldukça önemli role sahiptir. Hipotezimiz, insan uterus damarına ait endotel hücrelerindeki FasL ve Fas varlığı, menstrual siklus ile erken gebelik boyunca zaman ve alan bağlamında ilişkili olduğu ve bu proteinlerin ifadesinin steroid hormonlar (östrojen ve progesteron), interlökin 8 (IL-8), monosit kemotaktik protein- 1 (MCP-1) ve Lösemi inhibitor Faktör (LİF) gibi parakrin faktörler tarafından farklı şekilde düzenlendiğidir. FasL ve Fas moleküllerinin insan endometriyum hücrelerinde hem mRNA hem de protein düzeyinde hücre, alan ve zaman bağımlı olarak düzenlendiği tespit edildi. Ayrıca FasL 'in miyometriyum endotel hücreleri ile endometriyum endotel hücreleri tarafından siklus boyunca farklı düzenlendiği tespit edildi. Kullanılan mağnetik ayrıştırma tekniği ile insan endometriyum endotel hücreleri (HEEC) izole edilerek bu hücrelerin steroidler tarafıdan direk olarak hem proliferasyonlarınm hem de anjiyogenik kapasitelerinin arttırıldığı tespit edildi (östradiol, progesteron, ve östradiol+progesteron ile stimüle edilen hücreler, kontrol hücrelerine kıyasla anjiyogenik kapasitedeki artış istatiksel olarak anlamlılıydı (sırasıyla 3.0+0.1, 3.3+0.2, 3.1+0.1, 1.6+0.1, p<0.01). İn vivo bulgularımız ve yapılan HEEC kültürlerinde estogejin HEEClerde FasL'm varlığının düzenlenmesinde önemli rolü olduğu tespit edildi. Estradiol ile HEEC yüzeyinde FasL varlığının arttırılması sonucu HEEC-T lenfosit ortak-kültüründe T lenfositlerinde apoptos arttı (p<0.05). Ayrıca FasL'm hCG tarafından endometriyum epitel ve stroma hücrelerinde varlığını regüle ederek hem bu hücrelerde hem de T lenfositlerinde apoptosu artırdığı gözlendi (p<0.01). Endometriyumda kemokin reseptörleri CXCR1, CXCR2 ve CCR5 immnoreaktiviteleri immunohistokimya tekniği kullanılarak araştırıldı. İnsan stroma, gland ve endotel hücrelerin özellikle implantasyon fazında CXCRl'i arttırdığı tespit edildi (p<0.01). HEEC kültürlerinde ise HEEClerin MCP-1 ve IL-8 ile uyarılmasının 48. saatinde FasL seviyesinin belirgin olarak azaldığı saptandı. Sonuç olarak verilerimiz, 1. Endometriyum dokusundaki Fas ve FasL'ın, menstrual siklus ve erken gebelik boyunca uterusta zaman ve alan bağımlı olarak varolması endometriyumdaki apoptoz olayalarına aktif olarak katıldıklarını Fas ve FasL 'tan özellikle FasL seviyesi seks steroid hormonları ve hCG tarafından regüle edilerek maternal immun-toleransa katılabileceği; 2. Endometriyum endotelyumunda ekspre edilen FasL'm özellikle endometriyuma lökosit ekstravazasyonunun kontrolüne aktif olarak katıldığı ve östrojen ve kemokinler FasL seviyesini direkt olarak etkiliyebileceği; 3. İnsan endometriyum endotel hücrelerinin proliferative ve anjiyogenik kapasitelerinin hormonal olarak regüle edildiği ve kemokin reseptörleri için pozitif oldukları; 4. İnsan endometriyum endotel hücrelerindeki FasL varlığı endometriyum lökositlerinin dokuya infılitrasyonununda endotelyal hücrelerin fiziksel bariyerlerine ilaveten moleküler seviyede bir bariyer oluşturabileceğini önermektedir. IV

ABSTRACT Human uterus undergoes significant changes in terms of cellular and molecular levels throughout the life. According to these changes, uterus possesses a guide tissue aspect to investigate and understand many physiologic and pathologic events in human body. Besides, due to many reasons endometrial endothelial cells is one of the most important cells located in the center of the endometrial events. Fas- FasL system has significant roles in terms of initiation of apoptotic signal. Our hypothesis is that FasL and Fas expression of human uterine vascular endothelial cells undergoes spatial and temporal changes throughout the menstrual cycle and early pregnancy and sex steroid hormones (estrogen and progesterone), and some of paracrine factors such as interleukin-8 (IL-8), monocyte chemotactic protein- 1 (MCP-1) and Leukemia Inhibitory Factor (LIF) regulate expression of these proteins. FasL and Fas molecules were regulated in human endometrial cells in both mRNA and protein level in a cell-, region- and time- dependent manner. Moreover, FasL expression in myometrial endothelial cells is differently regulated compared to endometrial endothelial cells throughout menstrual cycle. Using magnetic separation technique human endometrial endothelial cells (HEEC) were isolated and this cells' proliferative and angiogenic capacities is directly regulated by sex steroid (angiogenic capacity of estradiol-, progesterone-, and estradiol + progesterone- stimulated cells was significantly increased when compared to control cells (3.0+0.1, 3.3+0.2, 3.1+0.1, 1.6+0.1, respectively, p<0.01). In vivo findings and estradiol stimulation of HEEC in culture revealed that estradiol has an important role in the regulation of FasL expression. Estradiol-stimulated up-regulation of FasL expression induces an increase of T lymphocytes apoptosis in HEEC-T lymphocyte co-culture (p<0.05). Furthermore, FasL up-regulation by hCG in endometrial epithelial and stromal cells results in an increased number of apoptosis in endometrial stromal cells and T lymphocytes (pO.01). In endometrium chemokine receptors CXCR1, CXCR2 and CCR5 immunoreactivity using immunohistochemistry technique were investigated. Human endometrial stroma, gland and endothelial cells showed an increased expression of CXCR1, especially in implantation window when compared to proliferative phase (pO.01). In HEEC culture MCP-1 and IL-8 induced a clear decrease in FasL level following the 48 h of induction. In conclusion our results suggest that, 1. Spatial and temporal expression of Fas and FasL in endometrial tissue throughout menstrual cycle and early pregnancy suggesting FasL and Fas take part actively in endometrial apoptosis cascade; 2. Regulation of Fas and FasL levels by sex steroid hormones and by hCG is likely to participate to maternal immuno-tolerance; 3. Presence of FasL in endometrial endothelium may actively regulate endometrial leukocyte extravasation and that FasL level may directly affected by estradiol and chemokines; 4. Human endometrial endothelial cells' proliferative and angiogenic capacity is regulated hormonally and they express chemokine receptors; 5. In addition to a physical barrier of endothelial cells, FasL expression of human endometrial endothelial cells may also be a barrier regulating endometrial leukocyte infiltration in terms of molecular level.