İnsan sperminde kromozomal anöploidiler ve morfolojik özellikler arasında ilişkilerin morfometrik ve floresan in situ hibridizasyon (FISH) yöntemleriyle araştırılması

Abstract

ÖZET Anormal sperm morfolojisi ile kromozomal anomaliler arasındaki ilişki, androloji çalışmalarında önemli bir ilgi alanıdır. Bununla birlikte, bugüne kadar yapılan çalışmalar, semen örneklerindeki anormal morfolojili veya anöploidili sperm oranları üzerine odaklanmışlar fakat hem anormal morfoloji hem de anöploidi gösteren tek bir spermdeki durumu araştırmamışlardır.Tek bir spermde her iki durumun aynı anda araştırılabilir olup olmadığını değerlendirebilmek için, çalışmamızda önce floresan in situ hibridizasyon (FISH) için gerekli prosedürler olan dekondenzasyon ve denatürasyondan sonra sperm şeklinin korunup korunmadığını araştırdık. Dekondenzasyon öncesi tek tek değerlendirilebilmek için, 21 slaytta toplam 395 sperm fıkse edildi, fotoğraftandı ve bilgisayar yardımıyla MetamorphT morfometri programı kullanılarak dijital ortama aktarıldı. Değişik şekillerdeki spermlerin benzer şekilde davranıp davranmadığını anlayabilmek için, spermler baş şekillerine göre, normal (N=115), ara form (N=115), anormal (N=115) ve amorf (N=50) olarak sınıflandırıldı. Dekondenzasyon ve izleyen denatürasyon işlemlerinden sonra, başlangıçta fotoğraflanan spermler tekrar lokalize edilerek morfometri uygulamak için dijital ortama aktarıldı. Baş alanı, çevresi, uzun ekseni, kısa ekseni, şekil faktörü ve kuyruk uzunluğu 395 spermin hepsinde hem doğal şekillerinde hem de dekondenzasyondan sonra tek tek değerlendirildi. FISH prosedüründe kullanılan dekondenzasyon ve denatürasyon protokolünden sonra, spermin orijinal boyutları ile orantılı olarak boyutları arttı. Sperm şekli, ister normal, ara form, anormal veya amorf kategoride olsun, başlangıçtaki şekline sadık kalarak korundu. Kromozom probları ile hibridizasyon işlemi de sperm şekli veya boyutları üzerine ileri bir etki yapmadı. Bütün bu bulgular bize, sperm şekliyle anöploidiler ve diploidiler arasında potansiyel bir direkt ilişki olup olmadığı konusunda ileri bir araştırma yapabilmemiz için olanak tanıdı. On beş oligospermik erkekten semen örnekleri alınarak slaytlara tespit edildi ve X, Y, 10, 11 ve 17. kromozomlar için sentromerik problar kullanılarak FISH uygulandı. Non-anöploid, disomik ve diploid spermler sınıflandırıldı ve görüntüler bilgisayarda morfometri programı ile incelendi. MetamorphT programı kullanılarak 15 hastadan toplam 30 slayt değerlendirildi (900 non-anöploidi, 256 disomi ve 130 diploidi, toplam 1286 sperm). Sonuçlarımız anormal sperm şekli ile disomi/diploidi arasında bir ilişkiyi desteklemektedir. Diploidi ve disomi oranları, sperm matürasyonundaki azalmaya doğru gidişi gösteren normalden amorfa kadar her kategoride artış gösterdi. Ayrıca, bu analiz için seçilen 386 spermden, disomili spermlerin %27'si ve diploidililerin %3'ü normal baş ölçülerine sahip 300 sperm arasındaydı. Bu bulguların, tek bir spermdeki sperm şekli ile sayısal kromozomal anormaliler arasındaki ilişkileri araştıran çalışmaları nasıl kolaylaştırdığını gösteren şekilleri de bu çalışmada veriyoruz. Elde edilen sonuçlar, spermi şekline göre normal, ara form, anormal veya amorf olarak sınıflandırdığımızda veya objektif morfometri yaptığımızda, anöploid ve diploid spermin herhangi şekildeki bir spermde bulunabileceğini göstermektedir. Sonuçta bu çalışma, ICSI'de sperm seçiminde kullanılan sadece şekle bakarak değerlendirmenin non-anöploid ve diploid sperm seçiminde güvenilir bir metot olmadığını göstermiştir. Anahtar Kelimeler: İnsan, sperm, morfometri, FISH, ICSI, kromozomal anomaliler. iv

ABSTRACT The relationship between abnormal sperm morphology and chromosomal aberrations has been of interest. Thus far, however, studies have focused on frequencies of sperm with either abnormal morphology or aneuploidies in semen samples, but not on detection of individual spermatozoa exhibiting both abnormal morphology and aneuploidy. In order to assess the feasibility of simultaneous evaluation of both attributes in an individual sperm cell, we first investigated whether sperm shape is preserved after decondensation and denaturation, procedures which are required for fluorescent in situ hybridization (FISH). On 21 slides, 395 sperm were fixed, photographed, and then digitized by the computer assisted MetamorphT morphometry program for individual evaluation before decondensation. In order to establish whether sperm of various shapes would behave in similar manners, the cells were also classified, according to their head shapes, into normal (N=115), intermediate (N=115), abnormal (N=115) and amorphous (N=50) categories. Following decondensation and subsequent denaturation, sperm photographed initially were re-localized and digitized for morphometry. Head area, perimeter, long axis, short axis, shape factor, and tail length were evaluated in each of the 395 sperm in both the native and decondensed states. After the decondensation and denaturation protocol of the FISH procedure, the sperm exhibited a proportional increase in dimensions as compared to their original sizes. Their initial shapes were preserved with high fidelity, whether the sperm were in the normal, intermediate, abnormal or amorphous categories. Hybridization with the chromosome probes had no further effect on sperm shape or size. These findings allowed us to further analyze the potential direct relationship between sperm shape and aneuploidies and diploidies. Semen samples from 15 men with borderline oligospermia were fixed on slides and FISH was performed using centromeric probes for the X, Y, 10, 11, and 17 chromosomes. Non-aneuploid, disomic, and diploid sperm were classified, and images were captured and further analyzed with computerized morphometry. In all, 30 slides from fifteen different patients were evaluated (900 non-aneuploid, 256 disomy, and 130 diploidy, 1286 sperm in all) with the MetamorphT program. Our results support a relationship between abnormal sperm shape and disomies/diploidies, as the combined rates of diploidy and disomy increased within each morphological category from normal to amorphous, reflecting the direction of diminished sperm maturation. Moreover, about 27% of sperm with disomy and 3% with diploidy of the 386 sperm selected for this analysis were among the 300 sperm that have normal head dimensions. We provide images to demonstrate how these findings facilitate studies on the relationship between sperm shape and numerical chromosomal aberrations in individual spermatozoa. We report that sperm preserve their shape after undergoing the process of decondensation and denaturation are a prerequisite for performing FISH. Whether categorizing sperm by shape, as normal, intermediate, abnormal or amorphous, or performing objective morphometry, the data indicate that aneuploid and diploid spermatozoa may occur in sperm of any shape. The data confirmed that shape assessment, used for ICSI sperm selection, is an unreliable method for selection of non-aneuploid or diploid sperm. Key Words: Human, sperm, morphometry, FISH, ICSI, chromosomal aberrations.