Deney modelinde zona pellusida ve embriyonik örtü proteinlerinin modifikasyonunda transglutaminaz aktivitesinin rolü

Abstract

ÖZET Transglutaminaz (TG) hücredışı matriks moleküllerini kovalent olarak bağlayarak dokuların yapılarını stabilize eden bir enzimdir. Zona pellusida, tüm Eutheria sınıfı (plasentalı) memelilerin ovositlerini çevreleyen saydam, hücredışı, glikoprotein yapıda bir matrikstir. Ovosite özgü bu yapı, folikülogenez süresince sentezlenir ve gebeliğin pre-implantasyon aşamasına değin kalıcıdır. Zona pellusidamn ince yapısı, biyokimyasal kompozisyonu ve biyolojik fonksiyonları gerçekleştirmek için gerekli olan moleküler mekanizmaların anlaşılması hem infertilite hem de yeni doğum kontrol yöntemlerinin geliştirilmesinde klinik öneme sahiptir. Bu çalışmanın amacı, TG immunoekspresyonunu döllenmemiş ve döllenmiş sıçan ovositlerinde belirleyerek, zona pellusidamn fonksiyonel özellikleriyle korelasyonunu kurmak ve TG enzimi ile sperm blokajı arasında bir ilişkinin olup olmadığım araştırmaktır. Ergin dişi Rattus norvegicus türü sıçanlar (n=36, 18 döllenmemiş, 18 döllenmiş) PMSG ve hCG ile süperovule edildi; fertil ya da vazektomize erkeklerle çifüeştirildi. Toplanan ovositlerde immunohistokimyasal olarak TG immünoekspresyonu, elektron mikroskobik olarak ince yapılan incelendi. Ayrıca western-blot tekniğiyle de ovaryum dokusunda TG ekspresyonu araştırıldı. Döllenmeden önce, sadece ovosit membranı ve kortikal sitoplazmik bölgeler kuvvetli TG immünopozitif olmasına karşın, döllenmeden sonra, kortikal sitoplazma daha az pozitifti; ovosit membranı ve perivitellin aralık daha fazla TG immunoreaktivitesi gösterdi. TG ekspresyonu aşamalı olarak yeni oluşmuş zigot ve 2-hücreli embriyonun zona pellusidasmda artarken, sitoplazma ve perivitellin aralıkta azaldı. TG aktivitesi ile korteks granüllerinin oluşumu ve salınımı arasında belirgin bir ilişki gözlendi. Sonuç olarak, TG immunoreaktivitesi ile döllenmeyi takiben monospermik bariyerlerin oluşumu arasında bir ilişkinin olduğu gözlenmektedir. Elektron mikroskobik olarak ZP gözenek çapı döllenmeden sonra anlamlı bir şekilde azaldı (pO.001). Halbuki ovosit ve zigotun çaplan arasında anlamlı bir fark yoktu. Ovositin yüzeyindeki gözenekler daha tekdüzeydi. Aksine zigotların gözenekleri çeşitli ve daha küçüktü. Zigotların ZP yapısı daha yoğundu. Çalışmamızda sıçan ovositi ve embriyolarında bölgesel ve zamansal heterojen bir TG immunoreaMvitesinin belirlenmesi zona pellusidamn döllenmedeki rolü açısından ilginçti. Aynca, ZP yapısının embriyolarda daha kompakt olması da zonanın bariyer görevini kanıtladı. Anahtar kelimeler: Sıçan, zona pellusida, transglutaminaz, immunohistokimya, ultrastrüktür

ABSTRACT Transglutaminase (TG) is an enzyme that stabilizes the structure of tissues by covalently ligating extra cellular matrix molecules. The zona pellucida is a translucent, extra cellular, glycoprotein matrix that surrounds the oocytes of all Eutherian mammals. This oocyte-specific structure is secreted during folliculogenesis and persists throughout the pre-implantation stage of pregnancy. An understanding of the biochemical composition of the zona pellucida and the molecular mechanisms by which it fulfils its biological functions is of clinical importance in the context of both infertility and the development of new approaches to contraception. The aim of this study is to identify the immunoexpression of TG of unfertilized and fertilized rat oocytes, in order to correlate its expression with the functional characteristics of the zona pellucida. Sexually mature female Rattus norvegicus strain rats (n=36, 18 pregnant, 18 pseudopregnant) were stimulated to superovulate with PMSG and hCG, then mated with either fertile or vasectomized males. Post-ovulatory oocytes were collected after mating. The oocytes were collected and examined by immunohistochemistry technique. In this study, TG expression was found to be developmentally regulated. Before fertilization, only the oocyte membrane and the cortical cytoplasmic regions express TG. After the fertilization, cortical cytoplasm becomes less positive, while the oocyte membrane and the perivitelline space contained more TG immunoreactivity. TG expression is gradually upregulated in the zona pellucida of the newly established zygote and the 2-cell embryo, but downregulated in the cytoplasm and perivitelline space. We have observed that the pore size of the ZP decreased significantly after fertilization (pO.001). However the diameter of the oocyte and zygote did not differ significantly. Our SEM observations revealed that the surface structure of oocyte contained many pores. These pores were uniformly distributed over the ZP. On the other hand the pores of the zygotes were not uniform and smaller. The ZP of the zygotes were more compact. Our data show that rat oocyte and embryos contain spatially and temporarily heterogeneous TG immunoreactivity interestingly in the zona pellucida relative to fertilization. In addition we found that the outer morphology of the ZP of fertilized oocytes was more compact as an evidence for zona barrier. Key words: Rat, zona pellucida, transglutaminase, immunohistochemistry, ultrastructure VI