Serebral kavernoz malformasyonlarla (Cerebral cavernous malformation, CCM) mutasyona uğrayan KRIT1`in anjiogenik sinyal yolunun moleküler mekanizması

Abstract

ÖZET Serebral kavemoz malforaıasyonlann (SKM) genetik temelim anlamaya yönelik yapılan moleküler genetik çalışmalar sonucunda hastalıkla ilişkili üç (Cerebral Cavernous Malformation 1-3) lokus tanımlanmış ve CCMİ lokusu içerisinde yer alan KRIT1 geni klonlanmıştır. KRIT1 geninde meydana gelen mutasyonlann otozomal dominant formda kalıtılan ve merkezi sinir sisteminde anormal vasküler yapıların oluşumu ile karakterize olan SKM'a neden olduğu gösterilmiştir. Yapılan son çalışmalar ile KRIT1 gen ürününün mikrotübül ilişkili bir protein olduğu ve ICAP-la ile ilişkiye girdiğinin gösterilmesine rağmen, KRIT1 proteinin fonksiyonu hala tam olarak bilinmemektedir. Bu nedenle bu çalışmada, ilk olarak moleküler yöntemler yardımıyla, KRIT1 proteininin insan dokularındaki dağılımı ve hücresel lokalizasyonu, in vivo ve in vitro anjiogenik model sistemlerinde KRTT1 ekspresyonu, daha sonra da KRIT1 proteininin anjiogenik faktörler ile regüle edilip edilmediği araştırıldı. SKM patofizyolojisine ışık tutmak için, in vitro KRIT1 ekspresyonu siRNA tekniğiyle inhibe edilerek, bu inhibisyona bağh olarak proliferasyon, adezyon, apoptozis gibi hücresel olayların nasıl değiştiği incelendi. KRITFin hemen hemen tüm dokularda eksprese edildiği, kapiller ve arteriollerde mevcut olduğu görüldü. KRITl'in endotelyal hücreler dışmda beyinde kan-beyin bariyerini oluşturan piramidal nöronlar, astrositler ve astrositik uzantılarda da eksprese edildiği gözlendi. în vitro anjiogenik sistemlerde KRITl'in kapilarizasyona bağh olarak ekspresyonunun arttığı, in vivo anjiogenik model sistem olarak kullanılan plasenta dokusunda ise KRITl'in aktif anjiogenik ve vaskülogenik alanlarda eksprese edildiği, fakat damar olgunlaşmasına bağh olarak KRIT1 ekspresyonunun azaldığı veya kaybolduğu görüldü. KRIT1 ekspresyonu inhibe edildiği zaman apoptozisin artmasına bağh olarak endotelyal hücrelerde proliferasyonun ve adezyonun azaldığı aynca KRIT1 ekspresyonunun baskılanmasına bağh olarak kapiller benzeri yapıların oluşmadığı görüldü. Bu bulgular 1) KRITl'in, endotelyal hücreler dışında astrositler, astrositik uzantılar ve nöronlarda da eksprese edilen bir protein olduğunu, 2) KRITl'in normal damar gelişimde rol oynayan bir protein olduğu ve ekspresyonunun anjiogenik faktörler ile regüle edilmezken, ekstrasehuler matriks proteinleri ile regüle edilebildiğini, 3) KRITl'in nüklear lokalizasyon sinyali bulunmasına rağmen, nükleusa göç etmediğini ve tirozin aminoasidi üzerinden fosforillenen bir fosfoprotein olduğunu, 4) KRIT1 ekspresyon düzeyindeki azalmanın hücre adezyon kapasitesini ve kapiller benzeri yapıların oluşumunu azalttığını göstermektedir. Böylece, KRIT1 gen ürününün, beyinde ekstrasehuler ve endotelyal hücreler arasında iletişimi sağlayan ve anjiogenezisde kapiller yapıların oluşumunda görev alan bir protein olduğu sonucu çıkarılabilir. IV

ABSTRACT Molecular genetic studies aimed at understanding the genetic basis of cerebral cavernous malformation (CCM) have been identified three loci, CCM1-3, that are associated with CCM, and KRIT1 gene located at CCM1 locus was cloned. Mutations in KRIT1 gene were demonstrated to cause CCM, an autosomal dominant disorder that is characterized with the formation of abnormal vascular structure in central nervous system. Although recent studies have suggested that KRIT1 is a microtubule-associated protein and interacts with ICAPla, the function of KRIT1 protein is still unclear. We first investigated KRIT1 expression level and cellular localization both in diverse human tissue and its expression in vivo-in vitro angiogenic model system, and then whether KRIT1 is regulated by angiogenic factors by molecular techniques. To understand the pathophysiology of CCM, we inhibited KRIT1 expression in endothelial cells by siRNA, in vitro, then examinated how the cellular changes such as proliferation, adhesion, and apoptosis are affected by blockage of KRIT1 expression. In our study, it was demonstrated that KRIT1 was expressed in a broad variety of human organs, it localized to the vascular endothelium of capillaries and arterioles. KRIT1 expression was seen in structure of blood-brain barrier such as astrocytes, astrocytic foot process as well as pyramidal neurons in addition to every endothelium studied. In vitro angiogenic system with the use of post-confluent endothelial cell cultures and 3D- collagen gels, KRIT1 expression was found to increase during the capillary like tube formations, and in placenta, the best established in vivo model of angiogenesis, KRIT1 expression was seen in angiogenic and vasculogenic areas of immature placenta villi, its expression was seen the decreased or lost in vascular structure depends on vessel maturation. When KRIT1 expression was inhibited, ratio of proliferation and the capacity of adhesion in endothelial cells was detected to decrease interestingly the endothelial cells depends on increased apoptotic ratio, and endothelial cells after inhibition of KRIT1 lost the ability of formation of capillary like tube structure in 3D angiogenic system. In conclusion, our results suggest that, 1) KRIT1 is a protein expressed in mainly endothelial cells as well as astrocytes, astrocytic foot process, and pyramidal neurons, 2) KRIT1 plays an important role in normal vessel development, its expression is regulated by extracellular matrix proteins, but not angiogenic factors such as VEGF or bFGF, 3) although it has nuclear localization signal, we found that it does not translocate to nucleus, and it is a phosphorylated protein on tyrosine amino acid, 4) inhibition of KRIT1 expression causes the reduction of proliferation and adhesion capacity as well as formation of capillary like structures, of endothelial cells We therefore conclude that KRIT1 is an essential protein, which provides the interaction between endothelial cell-cells or endothelial cells-extracellular matrix in brain is expressed during early angiogenesis by endothelial cells and might play a key role in vessel formation and/or development.