Rapamisin uygulamasının fare spermatogenik hücrelere etkisi

Abstract

Spermatogenez, hücre yenilenmesi ve farklılaşmasını içeren karmaşık bir süreçtir. Rapamisinin memeli hedefi (Mammalian target of rapamycin/mTOR) sinyal yolağı; hücre metabolizması, büyümesi ve kurtuluşunda merkezi bir düzenleyicidir. mTOR, çeşitli proteinler ile fiziksel ilişki kurarak, mTORC1(mTOR kompleks 1) ve mTORC2 (mTOR kompleks 2) protein komplekslerini oluşturur. mTOR inhibitörü rapamisine duyarlı olan mTORC1, hücre büyümesi için gerekli olan protein sentezini ökaryotik başlatma faktörü 4E (eIF4E)-bağlanma proteini 1 (4E-BP1) ve p70 ribozomal S6 Kinaz 1 (p70S6K1)'i fosforlayarak tetikler. Tüberoz Skleroz Kompleks (TSC2/Tuberin), mTOR aktivitesini negatif yönde düzenleyen bir tümör baskılayıcıdır. mTOR inhibitörleri, organ transplantasyonu hastalarında bağışıklık sistemini baskılamak için kullanılan ilaçlardır. Son yıllardaki raporlar rapamisinin, organ nakli hastalarında kullanılmasının testosteron düzeylerinde ve sperm sayılarında düşüşe neden olarak, fertiliteyi olumsuz etkilediğini ortaya koymaktadır. Rapamisin ve ilişkili mTOR sinyal yolağının sperm üretimi üzerine olan bu etkiyi ne şekilde gerçekleştirdiği hakkında literatürde bilgi oldukça eksiktir. Bu noktadan yola çıkarak birinci aşamada mTOR sinyal yolağı ile ilişkili proteinlerin erişkin fare testisinde esasen erken spermatogenik seri hücrelerinde ekspre olduğunu gösterdik. İkinci aşamada bu yolağın testiste ne şekilde rolü olabileceğini araştırmayı hedefledik. Çalışmada erişkin erkek farelerden kontrol, taşıyıcı ve rapamisin olarak 3 grup oluşturulmuştur. Farelerin testisinden elde edilen seminifer tübüller 24 saat seminifer tübül damla kültüründe kültüre edilmiştir. Rapamisin grubu 200 nmol rapamisin varlığında, taşıyıcı grubu etanol (rapamisin çözücüsü) varlığında kültüre edilirken, kontrol grubu %0,1 lik BSA içeren RPMI medyumu içerisinde kültüre edilmiştir. Kültür sonrası tüm gruplar için canlılık testi yapılmıştır. mTOR sinyal yolağı inhibisyonunun belirteci olan fosforile S6K, hücre bölünme belirteçleri olan PCNA, mayoz bölünmelere girişin belirteci olan Stra8 ve bir başka mayoz bölünme belirteci olan sycp3, germ hücre belirteci olan VASA ve mTOR sinyal yolağı ilişkili proteinlerinin ekspresyonları western blot tekniği ve immünohistokimya teknikleri ile gösterilmiştir. Tüm gruplara TUNEL metodu uygulanarak hücre ölümü değerlendirilmiştir. Tüm proteinlerin genlerinin mRNA düzeyleri, gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu ile belirlenmiştir. Tüm gruplarda hücre canlılıklarının eşit olduğu gözlenmiştir. Rapamisin grubunda kontrole oranla p-S6K, PCNA ve Stra8 ekspresyonlarının anlamlı derecede azaldığı gözlenmiştir. VASA ekspresyonunun tüm gruplarda eşit olduğu gösterilmiştir. Apoptoza uğrayan hücre sayılarında gruplar arasında anlamlı bir fark gözlenmemiştir. 4EBP1 seviyesinin rapamisin grubunda azaldığı gözlendi. VASA ve PCNA genlerinin mRNA seviyelerinin rapamisin uygulanan gruplarda diğer gruplara göre anlamlı bir şekilde arttığı gözlenmiştir. Çalışmamız mTOR sinyal yolağının spermatogonyal kök hücrelerin proliferasyonu ve mayoz bölünmeye girerek farklanmasında rolü olabileceğini gösteren ilk fonksiyonel çalışmadır. Bu çalışma mTOR sinyal yolağının erkek üreme sistemindeki rolüne ek olarak ileride yapılacak olan kök hücre çalışmaları için ışık tutabilecek bulguları ortaya koymuştur.

Spermatogenesis is a complex process of cellular renewal and differentiation. mTOR signaling pathway serves as a central regulator of cell metabolism, proliferation and survival. mTOR forms two protein complexes, mTORC1 and mTORC2, by interacting various proteins. Rapamycin sensitive-mTORC1 positively controls protein synthesis by phosphorylating the eukaryotic initiation factor 4E (eIF4E)- binding protein 1 (4E-BP1) and the p70 ribosomal S6 kinase 1 (p70 S6K1). Tuberous sclerosis complex (TSC/Tuberin) is a negative regulator of mTORC1. mTOR inhibitors are immunosuppressive drugs used in organ transplantation patients. Recently, several studies have emphasized potential impact of rapamycin on male gonadal function by decreasing testosterone levels and sperm counts. Recently, we have shown immunohistochemical distributions of mTOR signalling proteins in early spermatogenic cells of adult mice. Thus; we aimed to investigate the effect of rapamycin administration to spermatogenic cells utilizing seminiferous tubule cultures from adult mice. We grouped adult mice as control, vehicle and rapamycin. We used 200 nmol rapamycin. We cultured vehicle group mice with ethanol (solvent of rapamycin) and control group seminiferous tubules with %0,1 BSA and RPMI medium for 24 hours. After culture cell viability assay were performed at 0. And 24 hours. Western blot and immünohistochemistry were applied for p-S6K, PCNA, Stra8, VASA, Sycp3 and proteins associated mTOR signaling pathway. For all groups TUNEL was performed for cell death. mRNA levels were evaluate with RT-PCR. Our results have indicated that cell viability was similar between groups. For western blot analysis p-S6K, PCNA and Stra8 expression was decreased in rapamycin administrated group significantly. No differences were observed for VASA expression between the groups. For all groups the number of apoptotic cells was similar. 4EBP1 levels decreased in rapamycin group. mRNA levels of VASA and PCNA increased significantly in rapamycin administrated group. This is the first functional study that reports mTOR signaling pathway may have an important role in spermatogonial proliferation and differentiation. Our findings would also contribute to stem cell studies as well.