Fare preimplantif embriyo gelişim sürecinde FOXO1, FOXO3 ve FOXO4 ekspresyonlarının değerlendirilmesi

Abstract

Embriyo fallop tüplerinden uterusa doğru yol alırken implantasyona hazırlanır ve endometriyuma implante olana kadar geçirdiği süreç preimplantasyon dönem embriyo gelişimi olarak tanımlanır. Preimplantif dönemdeki embriyo, yarıklanma bölünmelerine başladığında; 1 hücreli, 2 hücreli, 4 hücreli, 8 hücreli, morula ve blastosist aşamasındaki embriyoyu oluşur. Preimplantif embriyo gelişim süreci, maternal çevrede bulunan büyüme faktörleri tarafından üretilen sinyallere bağlı olarak pek çok farklı hücresel olay tarafından etkilenmektedir. PI3K/Akt sinyal yolağı, büyümeyi ve gelişmeyi destekleyen pek çok sinyal yolağından birisidir. FoxO transkripsiyon faktörleri, nükleusta görev yaparlar ve aktiviteleri PI3K/Akt sinyal yolağı tarafından düzenlenir. Memelilerde, FoxO1, FoxO3a, FoxO4 ve FoxO6 olmak üzere dört adet FoxO ailesi üyesi tanımlanmıştır. FoxO'lar; glikoz metabolizması, enerji homeostazı, hücresel farklanma, oksidatif strese karşı dayanıklılık, hücre siklusunun duraklaması, DNA tamiri ve apoptozun düzenlenmesi, gibi süreçlerde önemli roller oynarlar. Büyüme faktörleri varlığında sitoplazmada lokalize olan FoxO'lar, oksidatif stres ya da genotoksik stres gibi koşullarda nükleusa göç ederler ve hedef genlerin transkripsiyonunu sağlarlar. FoxO moleküllerinin dişi ve erkek üreme sisteminde ve fertilitenin korunup devamlılığının sağlanmasındaki önemli rolleri ve FoxO transkripsiyon faktörlerini düzenleyen PI3K/Akt sinyal yolağının, oosit matürasyonunda ve preimplantif embriyo gelişim sürecinde varlığı yapılan çalışmalar ile gösterilmiştir. Tüm bu bilgiler, bir yandan çoğalırken diğer yandan farklanan ve mikroçevresi sürekli değişirken ortama adapte olmaya çalışan preimplantif gelişim sürecindeki embriyoda, FoxO transkripsiyon faktörlerinin de ekspre olabileceği sorusunu akla getirmektedir. Bu çalışmanın amacı, preimplantasyon embriyo gelişim sürecinde FoxO transkripsiyon faktörlerinin ekspre olup olmadığının, eğer oluyor ise hücredeki lokalizasyonlarının belirlenmesidir. Çalışmamızda 5-6 haftalık Balb/C ırkı dişi fareler kullanılarak hormonal indüksiyon (PMSG ve hCG) ile; profaz I, metafaz I ve metafaz II evresindeki oositler ve erişkin Balb/C ırkı erkek fareler ile çiftleşme sonucunda elde edilen 1 hücreli, 2 hücreli, 4 hücreli, 8 hücreli, morula ve blastosist aşamasındaki embriyolar fallop tüpleri ve uteruslarından toplanmıştır. İmmünfloresan yöntemi kullanılarak; FoxO1, FoxO3 ve FoxO4 proteinlerinin ekspresyonları ve lokalizasyonları ortaya konmuştur. Çalışmamız; profaz I, metafaz I ve metafaz II oositlerinde ve 1 hücreli, 2 hücreli, 4 hücreli, 8 hücreli, morula ve blastosist aşamasındaki embriyolarda, FoxO1, FoxO3 ve FoxO4 proteinlerinin farklı düzeylerde ekspre edildiğini gösteren literatürdeki ilk çalışmadır. Sonuçlarımız, in vivo embriyo gelişimi sürecinde sitoplazmada ekspre olduğu belirlenen FoxO transkripsiyon faktörlerinin özellikle in vitro embriyo gelişimi sırasında veya stres koşullarında (pH, oksijen düzeyi, ısı değişimleri gibi) ekspresyonlarının ne şekilde olabileceği ile ilgili yapılabilecek çalışmalar için temel oluşturmuştur. Özellikle yardımcı üreme tekniklerinde embriyo gelişim süreçlerinde FoxO transkripsiyon faktörlerinin araştırılması ile ilgili ileri çalışmalar laboratuvarımızda devam etmektedir.

After fertilization, while passing through the fallopian tubes to enter the uterus, embryo gets prepared for implantation. The period between fertilization and implantation is defined as preimplantation embryo development. Fertilized zygote starts to cleave and develops into 2 cell, 4 cell, 8 cell embryo, morula, and blastocyst. Preimplantation embryo developmental period is affected by various cellular events that depend on signals generated by growth factors present in the maternal environment. The PI3K/Akt pathway is one of these pathways that support growth and development. FoxO transcription factors are members of a subgroup of Forkhead family which are characterized by a conserved DNA-binding domain and function in the nucleus. Their activities are regulated by PI3K/Akt signalling pathway. In mammals, there are four FoxO genes, FoxO1, 3, 4, and 6. FoxO transcription factors are at the interface of crucial cellular processes, orchestrating programs of gene expression that regulate apoptosis, cell-cycle arrest, and oxidative stress resistance, DNA repair, glucose metabolism, energy homeostasis and differentiation. In the presence of growth factors, FoxO transcription factors are localized in the cytoplasm. Under stress conditions such as oxidative stress and genotoxic stress, FoxO transcription factors move to the nucleus and trigger transcriptional activities of their target genes. Studies have shown that FoxO molecules play important roles and protect fertility in male and female reproduction. Additionally, it has been shown that the PI3K/Akt signaling pathway, the main regulator of FoxOs', is present both in the oocyte and in the preimplantation embryo. Thus, the aim of the present study is to investigate whether FoxO transcription factors are present during oocyte maturation and preimplantation embryo development. Female Balb/C mice were superovulated with PMSG and hCG and then prophase I, metaphase I, metaphase II oocytes, 1 cell embryo, 2 cell embryo, 4 cell embryo, 8 cell embryo, morula and blastocyst were collected from their fallopian tubes and uterus. Presence and localizations of FoxO1, FoxO3 and FoxO4 proteins have been determined with immunofluorescence staining. Our results have confirmed that FoxO1, FoxO3 and FoxO4 proteins are differentially expressed in prophase I, metaphase I, metaphase II oocytes and in 1 cell embryo, 2 cell embryo, 4 cell embryo, 8 cell embryo, morula and blastocyst. Our findings are the first results in the literature showing that FoxO transcription factors are present during both oocyte and embryo in vivo maturation. These findings may provide basic information for planning future studies which investigate whether these factors are affected or not when the embryo faces stress conditions (such as pH, oxygen level or temperature changes) during in vitro maturation, especially in the IVF laboratories. Based on the findings of the present study, new studies are in progress in our laboratory.