Stz-indüklenmiş diyabetik fare ovaryumunda endoplazmik retikulum stresi (ERS) ilişkili protein ekspresyonlarının değerlendirilmesi

Abstract

Hücre organellerinden biri olan endoplazmik retikulumun (ER) başlıca görevi; yeni oluşan sekretuvar ve membran proteinlerin olgunlaşmasını ve tersiyer yapılarda doğru katlanmalarını sağlamaktır. N-bağımlı glikozilasyon inhibisyonu, kalsiyum dengesinin bozulması, hipoksi, oksidatif stres, glukoz yoksunluğu, viral enfeksiyonlar ve ortamın sıcaklığı gibi çevresel koşullar, yanlış katlanmış ya da katlanmamış proteinlerin ER lümeninde birikmesine yol açarak ER stresi (ERS) adı verilen olayı meydana getirir. ERS'ye cevap olarak hücrede dengeyi yeniden sağlamak için katlanmamış protein cevabı (Unfolded Protein Response, UPR) adı verilen sinyal yolağı aktif hale gelir. UPR veya ERS cevabının çeşitli fizyolojik durumlara karşı etkili bir adaptasyon mekanizması olduğu bilinmekle birlikte diabetes mellitus gibi hastalıkların fizyopatolojisi ile ilişkisi olduğu bildirilmiştir. Diyabetle indüklenmiş hiperglisemi ya da glukoz emilimindeki yetersizliğin fare granuloza hücrelerinin apoptozuna yol açtığı ve oositlerde; mayozun ilerlemesini azalttığı, düşük oosit kalitesine neden olduğu bilinmektedir. Hiperglisemik koşulların fare ovaryumlarında yarattığı olumsuz sonuçların nedenleri arasında, bozulan protein sentez mekanizması, ERS'nin ve buna cevap olarak ortaya çıkan hücre kaderini belirleyen UPR mekanizmasının rolleri olabilir. Çalışmamızda, 24 günlük toplam 31 adet BalbC ırkı dişi fare kullanılarak üç grup oluşturuldu: 1) kontrol grubu (herhangi bir uygulama yapılmayan grup) (n=10), 2) çözgen grubu (intra peritonel (i.p) 100 µl sodyum sitrat enjekte edilen grup) (n=6), 3) diyabet grubu (n=15) (tek doz 90 mg/kg streptozotosinin (STZ) i.p. olarak enjekte edilen grup). Diyabet modelinin takibi için, STZ enjeksiyonu takiben 2. , 7. ve 14. günlerde kan şekerleri ölçüldü. Kan şekeri değeri 300 mg/dl'nin üzerinde çıkan dişiler diyabetik kabul edildi. 14 günlük takip süresinin sonunda dişiler sakrifiye edilerek ovaryum örneklerinde ERS proteinlerinin (GRP78, DDIT3, KASPAZ 12 ve p-PERK) lokalizasyonları ve ekspresyon seviyelerini göstermek amacıyla immünohistokimya ve western blot yöntemleri uygulandı. qRT-PCR yöntemi ile ERS belirteçleri olan Grp78 ve Ddit3 genlerine ait mRNA ekspresyon seviyeleri incelendi. Diyabet grubuna ait ovaryum örneklerinde p-PERK ve DDIT3 proteinlerinin immün boyanmaları kontrol ve çözgen gruplarına kıyasla anlamlı olarak arttığı gözlendi. Her iki proteininde immün boyanmaları özellikle atretik foliküllerde, apoptotik granüloza hücrelerinde ve dejenere ovositlerde görüldü. Ovaryumlarda p-PERK, GRP78 ve Kaspaz 12 protein miktarı açısından gruplar arasında anlamlı farklılık olmadığı belirlendi. Grp78 mRNA düzeyi gruplar arasında anlamlı bir farklılık göstermemiştir. Ddit3'ün mRNA miktarı diyabetik gruplarda anlamlı olarak artarken protein düzeyinde gruplar arası herhangi bir farklılık gözlenmemiştir. XBP1s protein miktarının ise diyabetik ovaryumlarda arttığı gözlenmiştir. Sonuç olarak; diyabetin fare ovaryumlarında ERS'yi başlatarak UPR'yi tetiklediği tespit edilmiştir. Anahtar Kelimeler: ERS, Diyabet, UPR, Fare, Ovaryum.

Main function of endoplasmic reticulum (ER) is to facilitate the proper folding of newly synthesized secretory and membrane proteins into native three-dimensional structures. Various triggers result in the onset of accumulation of unfolded or misfolded proteins in ER lümen including inhibition of N-linked glycosylation, perturbations in Ca2+ homeostasis, hipoxia, oxidative stress, glucose deprivation, viral infections and environmental conditions like ambient temperature, condition known as ER stress. In response to ER stress, unfolded protein response (UPR) signalling pathway is activated to retain cellular homeostasis. Although, UPR or ER stress response is an efficient adaptation mechanism for the cells, it was shown that it is also related to various pathophysiology of diseases, including diabetes. Diabetes-induced hyperglysemia or glucose absorbation inefficiency consistently causes granulosa cell apoptosis and reduced meiosis resumption rate in oocytes and low oocyte quality. Both ER stress and UPR may have a role in series of negative impacts on mice ovaries caused by hyperglycemic conditions by determining the cell fate.In this study, 24-days-old BalbC female mice (N=31) were used and designed as three groups: Control (n=10, no treatment), Vehicle (n=6, i.p. 100 µl natrium citrate injected group), Diabetic (n=15, STZ-injected group (i.p. 90 mg/kg BW in 100 µl natrium citrate). To control STZ-induced diabetic model, blood glucose level was measured following the injection days on 2nd, 7th and 14th. Mice whose blood sugar is over 300 mg/dl were accepted as the diabetic. The day of 14th, mice were sacrificed and ovary samples were examined with immunohistochemical staining and western blot analysis to show localisation and the expression levels of ER stress proteins (GRP78, Caspase 12, p-PERK and DDIT3). Additionally, with using qRT-PCR analysis mRNA level of Grp78 and Ddit3 genes which are the indicators for ER stress were examined. It was observed that the immun reaction for p-PERK and DDIT3 was significantly increased in diabetic ovaries, especially in atretic follicles, apoptotic granulosa cells and degenerated oocytes. In ovaries, protein expression of Caspase 12, p-PERK and GRP78 was not showed any statistically differences among experimental groups. There was no significant differences among experimental groups for an amount of Grp78 mRNA. Compair to control and vehicle group, Ddit3 mRNA was significantly increased in diabetic group while amount of DDIT3 protein was not significantly differences among groups. XBP1s protein expression was increased in diabetic group which were statistically significant than control and vehicle. In conclusion, it is detected that diabetes can initiate ERS and stimulate UPR in mice ovaries. Keywords: ERS, Diabetes mellitus, UPR, Mice, Ovary