Diyabetik ve büyüme geriliği oluşturulmuş sıçan plasentalarının gelişiminde Akt ve ERK1/2 proteinlerinin rollerinin immünohistokimya ve Western Blot metodlarıyla belirlenmesi

Abstract

Plasenta maternal metabolizmada meydana gelen değişiklerden etkilenmekte ve fetüsün yaşama şansını arttırabilmek için bu değişikliklere yanıt vermektedir. Aşırı glikoz ve glukokortikoide maruz kalma çeşitli plasental ve fetal patolojilere yol açmaktadır.Hücre içi sinyal iletim yolaklarında görev alan Akt ve ERK1/2 proteinleri plasental gelişimde önem taşımaktadır. Ancak diyabet ve IUGR (uterus içi büyüme geriliği) görülen plasentalarda Akt ve ERK1/2 proteinlerinin hücresel lokalizasyonları ve fosforilasyonlarının plasental gelişim üzerindeki etkilerine dair bilgiler sınırlıdır. Bu nedenle bu çalışmada diyabet ve IUGR görülen plasentalarda Akt ve ERK1/2 proteinlerinin ve bu proteinlerin fosforile formlarının hücresel dağılımları ve protein miktarları immünohistokimya ve Western Blot metodlarıyla incelendi.Çalışmada IUGR grubunu oluşturacak olan gebe dişilere, gebeliğin 10. ve 12. günlerinde deksametazon enjeksiyonuna başlandı. 10. günde enjeksiyona başlanan grup 12. günde sakrifiye edildi. Enjeksiyona 12. günde başlanan gruplar 14, 16, 18 ve 20. günlerde sakrifiye edildiler. Enjeksiyonun yapıldığı ilk gün 100 µg/kg olacak şekilde boyun bölgesinden subkutan olarak deksametazon enjekte edildi. Sonraki günlerde 200µg/kg olacak şekilde deksametazon verilmeye devam edildi. Kontrol gruplarına aynı miktarlarda serum fizyolojik enjekte edildi. Diyabet grubunu oluşturacak olan gebe dişiler, diyabet oluşturabilmek için sakrifiye edilecekleri tarihten yedi gün önce intraperitonel olarak tek doz 40mg/kg streptozotosin (STZ) enjeksiyonuna maruz bırakıldılar. 48 saat sonra kan şekerleri ölçüldü. Kan şekeri değeri 200mg/dl'nin üzerinde çıkan dişiler diyabetik kabul edilerek deneye dahil edildiler. Kontrol gruplarına, aynı miktarda serum fizyolojik enjekte edildi. Toplanan plasenta örnekleri immünohistokimya ve Western Blot yöntemleriyle incelendi.Akt fosforilasyonunun kontrol grubuna kıyasla, IUGR (14. gün hariç) ve diyabet (12. gün hariç) gruplarında anlamlı olarak azaldığı gözlendi. İmmün boyanmalar özellikle bağlantı zonu hücrelerinde belirgindi. IUGR ve diyabet gruplarında immün boyanmalarda azalmalar gözlendi. ERK1/2 fosforilasyonunun IUGR grubunda gebeliğin 12 ve 16. gününde arttığı diğer günlerde ise azalma olduğu tespit edildi. Bu farklar 16 ve 18. günlerde anlamlı idi. Diyabet gruplarında 12. gün hariç diğer günlerde ERK1/2 fosforilasyonunun azaldığı belirlendi. Bu azalma 14 ve 16. günlerde anlamlı idi. ERK1/2 fosforilasyonu tüm gruplarda gebeliğin ortalarına doğru azalış, 18. günde itibaren tekrar artış gösterdi. Fosfo-ERK1/2 immün boyanmaları bağlantı zonu hücrelerininin yanı sıra labirint zon hücrelerinde de belirgin olarak mevcuttu.Sonuç olarak sıçan plasentalarında IUGR ve diyabet etkisi ile Akt ve ERK1/2 proteinlerinin aktivasyonlarının azaldığı dolayısıyla hiperglisemi ve aşırı maternal deksametazona maruziyette bu iki sinyal iletim yolağının etkilendiği tespit edilmiştir. IUGR plasentalarında görülen ağırlık azalmaları ile diyabetik plasenta ağırlıklarında gebeliğin ortalarına doğru azalma, 18. günden itibaren artma gözlenmesinde Akt ve ERK1/2 proteinlerinin dolayısıyla PI3K-Akt ve MAPK-ERK1/2 yolaklarının rol oynadığı söylenilebilir.

Placenta is affected by the changes in maternal metabolism and give response to these changes to optimise the fetal survival. Overexposure to maternal glucose and glucocorticoids causes several placental and fetal pathologies.Akt and ERK1/2 are signal transduction proteins and have important roles in placental development. However, there is scarce data about phosphorylation and immunolocalization of these proteins in diabetic and IUGR (Intrauterine Growth Retardation) placentas. Therefore in this study we aimed to determine to immunolocalization and phosphorylation of Akt and ERK1/2 by immunohistochemistry and western blot techniques.In order to compose IUGR group, pregnant females were injected with 100µg/kg dexamethasone on the 10th and 12th day of gestation subcutaneously. Enjections continuied as 200µg/kg until the day they were sacrificed. Rats that were dexamethasone injected on the 10th day of gestation were sacrificed on the day 12 of gestation. The pregnant rats, whose dexamethasone injection started on the 12th day, were sacrificed on the 14th, 16th, 18th and 20th day of their gestation. The control groups were injected same dose isotonic salt solution.The females that take part in diabetic group was injected 40mg/kg streptozotocin (STZ) intraperitonally seven days before the sacrification. After 48 hours blood glucose was measured. Rats whose blood sugar is over 200 mg/dl were included in the diabetic group. The control groups were injected same dose isotonic salt solution. Placenta samples were examined with immunohistochemical and western blot techniquesIt was observed that Akt phosphorylation was reduced significantly in IUGR (except day 14) and diabetic (except day 12) placentas. Immune reactions were significant in the junctional zone of the rat placenta and decreased in the IUGR and diabetic groups. ERK1/2 phosphorylation was increased at 12th and 16th days of gestation and decreased in the other days of gestation in IUGR groups. The results were statistically significant at 16th and 18th days. In diabetic groups ERK1/2 activation was decreased in all groups except day 12. The differance was significant at 14th and 16th days. In all groups ERK1/2 phosphorylation was reduced until the mid-gestation and increased after the 18th day of gestation. Phospho-ERK1/2 immune reactions were not only significant in the junctional zone, it was also significant in the labyrinth zone of the placentas.In conclusion, in diabetic and IUGR rats phospho-Akt and phospho-ERK1/2 expressions were reduced. It is detected that these proteins were negatively affected by over exposure to maternal hyperglycemia and dexamethasone. As a result, the small placentas in the IUGR groups and the small placentas observed on early stages and placentomegaly observed during late stages of pregnancy in the diabetic groups may be a result of disturbed PI3K-Akt and MAPK-ERK1/2 pathways.