Kan-testis bariyerinin düzenlenmesi`nde rol alan sinyal yolaklarının araştırılması

Abstract

Amaç: Kan-testis bariyerinin (KTB) yeniden modellenmesi, aktin-tabanlı hücre iskeletinin yeniden organizasyonu ile gerçekleşmektedir. Bu çalışmada, hücresel Src kinaz (c-Src) substratı olan, hücre membranı ile aktin hücre iskeletine bağlanma özelliği gösteren ve Fokal adezyon kinaz (FAK) ile aktive olduğu bilinen ezrin proteininin KTB'deki fonksiyonel öneminin gösterilmesi amaçlanmıştır.Yöntem: Primer sıçan Sertoli hücresi kültüründe in vitro olarak ve sıçan testisinde in vivo olarak RNA interferens (RNAi) aracılı ezrin yerleşimi sessizleştirilen modelde; kan-testis bariyeri bütünlüğü analizleri gerçekleştirilmiştir. KTB bütünlüğü Sertoli hücresi kültüründe, transepitelyal rezistans (TER) ölçümleri ile testiste ise fluoresan izotiyosiyanat (FITC)-inülin aracılı ajan ile değerlendirilmiştir. Ardından Sertoli hücresi lizatları ve testis lizatları elde edilerek, RT-PZR, immunoblot, immünoflüoresan ve ko-immunopresipitasyon yöntemleri ile ezrin ilişkili KTB düzenleyici proteinler araştırılmıştır.Bulgular: Ezrin yerleşiminun bazal ektoplazma özelleşmelerinde (BEÖ), seminifer epitel döngüsünün geç evre VIII'den evre IX' a kadar olan süreçte; apikal ektoplazma özelleşmelerinde (AEÖ) ise sadece evre VIII'e özgü ve basamak 19 spermatid- Sertoli arayüzünde sınırlı olduğunu gösterdik. Ezrin proteininin Sertoli hücresi kültüründe baskılanması ile aktin mikrofilamanlarının yapısındaki bozulmalar, KTB düzenleyen proteinlerin düzeylerinde ve lokalizasyonlarında değişiklikler tespit ettik. Ezrinin in vivo baskılanması ile spermatid taşınmasının geciktiğini gösterdik. Spermiyasyondaki bazı defektlere neden olan bu gecikmenin, spermatidlerin epitelin derinlerinde gömülü olması ve spermatid polaritesinin kaybına bağlı olduğu tespit ettik. Ayrıca, ezrinin atık sitoplazmalar ve fagozomlar ile ilişkili dağılım gösterdiğini, baskılandığında ise atık sitoplazmaların ve fagozomların apikalden bazal kompartmana doğru taşınmasında gecikmelere sebebiyet verdiğini ortaya koyduk.Sonuç: Ezrinin, spermatogenez sürecinde aktin mikrofilaman organizasyonun düzenlemesini etkilediğini gerek in vitro gerekse in vivo olarak gösterdik. KTB yeniden kurulumunda BEÖ ve AEÖ düzenleyici proteinlerinin lokalizasyonlarını etkileyerek spermatogenezi bozduğunu doğruladık.Anahtar Kelimeler: Seminifer epitel döngüsü, kan-testis bariyeri, ektoplazma özelleşmeler ezrin, F-aktin

Objective: During spermatogenesis, the transport of spermatids and the release of sperms at spermiation and the remodeling of the blood-testis barrier (KTB) in the seminiferous epithelium of rat testes require rapid reorganization of the actin-based cytoskeleton. However, the regulatory molecule(s) remain unexplored. In this study, we aim to show the funcitonal importance of ezrin which belongs to FAK activation, as c-Src substrate and also has adhesive to cell cytoplasm beetween actin and the cell membrane.Method: By using in vitro primary rat Sertoli cell culture, and in vivo rat testis, siRNA duplexes were occurred to analysis blood testis-barrier integrity with Transepithelial Resistance (TER) measurements, FITC-inulin analysis, RT-PCR, immunoblot, immunoflüoresant and co-immunoprecipitation experiments.Results: Ezrin is expressed at the basal ES/KTB in all stages, except from late VIII to IX, of the epithelial cycle. Its knockdown by RNA interference (RNAi) in vitro perturbs the Sertoli cell tight junction-permeability barrier via a disruption of the actin microfilaments in Sertoli cells, which in turn impeded basal ES protein distribution, perturbing the KTB function. These findings were confirmed by a knockdown study in vivo. However, the expression of ezrin at the apical ES is restricted to stage VIII of the cycle and limited only between step 19 spermatids and Sertoli cells. A knockdown of ezrin in vivo by RNAi was found to impede spermatid transport, causing defects in spermiation in which spermatids were embedded deep inside the epithelium, and associated with a loss of spermatid polarity. Also, ezrin was associated with residual bodies and phagosomes, and its knockdown by RNAi in the testis also impeded the transport of residual bodies/phagosomes from the apical to the basal compartment.Conclusion: Ezrin has an important effect in FAK signalling pathway and BTB restructing by regulating actin microfilament organization at the ES in rat testes. In summary, both in vitro and in vivo knockdown of ezrin distrupt BTB and spermatogenesis, respectively.Key words: Seminiferous epithelial cycle, blood-testis barrier, ectoplasmic specialization, ezrin, F-actin