3. jenerasyon hıv tabanlı lentiviral vektörlerin ın vıvo uygulamalar için üretimi ve pürifikasyon yöntemlerinin optimizasyonu

Abstract

Amaç: Lentiviral vektörler (LVV); güvenlik, etkinlik ve uzun süreli ekspresyon açısından tercih edilen, klinik gen tedavi denemelerinde kullanımı her geçen gün artan gen nakil araçlarıdır. Bu vektörlerin terapötik etkinlikleri, üzerlerinde taşıdıkları genlere bağlı olsa da, in vivo uygulamalarda kullanılmaları için, yüksek kalite ve saflıkta üretilmeleri gerekmektedir. Dolayısıyla hem deneysel hem klinik çalışmalarda kullanılabilirliğini arttırabilmek için yeni üretim ve saflaştırma metotları geliştirilmelidir. Yapılan çalışmada, in vivo gen nakil uygulamalarında kullanılmak üzere, uygun titre ve kalitede; yüksek saflıkta, biyogüvenilir lentivirus eldesi için, vektör konsantrasyon ve pürifikasyon tekniklerinin geliştirilmesi hedeflenmiştir.Yöntem: Döner hücre kültürü şişelerindeki 293T hücrelerinin, paketleme ve transfer plazmidleriyle, Chloroquine varlığında geçici CaPO4 transfeksiyonu sonucu 3. nesil LVV üretildi. Ardından düşük hızda santrifügasyon ve filtrasyon ile hücresel debris giderimi yapılıp, sükroz yataklı, yüksek hızlı ultrasantrifüj işlemi ile virus konsantrasyonu gerçekleştirildi. Konsantre edilen viral örnekler; hücresel nükleik asit yıkımı için benzonaz ile muamele edildikten sonra, iyon değişim kromatografisi ile saflaştırma işlemine tabi tutuldu. Elde edilen vektörlerin genoma entegre kopya sayıları kantitatif Real-Time PCR ile hesaplanırken, protein giderim oranları SDS-PAGE ile belirlendi ve MTT testi ile bu vektörlerin hücre canlılığına etkisi değerlendirildi.Bulgular: Yapılan optimizasyon işlemleri ardından %10 FBS ve 25 uM Chloroquine içeren IMDM besiyerindeki transfeksiyonu takiben %10 FBS içeren OPTIMEM besiyerinde yapılan viral üretim metoduyla transdüksiyon etkin LVV'ler başarıyla elde edildi. Viral titre, fonksiyon ve saflık analizleri doğrultusunda, ultrasantrifüj ile 200 kat konsantre edilen örneklerin kromatografik pürifikasyonu ile safsızlıklarından %90 oranında arındırıldığı belirlenirken, viral titre 6,2x10^10 TU/mL olarak hesaplandı. LVV üretiminin başlangıcından son ürüne dek yapılan tüm alt akım işlemlerinin ardından HIV p24 ELISA testi ile toplam vektör geri kazanımı %53 olarak belirlendi.Sonuç: Gerçekleştirdiğimiz bu çalışma ile, genel laboratuvar koşullarına uyarlanabilir özellikte ve oldukça pratik, optimize ve ölçeklendirilebilir bir üretim ve saflaştırma metodu geliştirilmiştir.

Aim: Lentiviral vectors (LVV) are gene transfer tools, which have been preferred in clinical gene therapy trials in terms of their safety, efficacy and long-term gene expression. Despite the therapeutic effectiveness of these vectors is mostly dependent on the genes they carry, they must be produced in high quantity and purity for their successful in vivo applications. Thus, there is a need for a practical, scalable, a robust vector production method applicable to any basic laboratory settings. Thus, the aim of this study is to design a lentiviral production and purification technique to obtain high titered, bio-safe, 3rd generation LV vectors for in vivo gene transfer applications. Methods: The 3rd generation LVV was produced in roller bottles, by temporarily transfecting 293T cells with packaging and transfer plasmids in the presence of Chloroquine and CaPO4. Following clearance of cellular debris by low-speed centrifuge and filtration, virus was concentrated by high-speed ultracentrifugation in the presence of sucrose-cushion. Concentrated viral samples were then purified by anion-exchange chromatography after benzonase treatment to remove cellular DNA. Viral titers were quantified by RT-PCR, purity was determined by SDS-PAGE, and effect of virus on cellular viability was assayed by MTT test.Results: Transfections performed in IMDM containing 10% FBS and 25µM Chloroquine resulted in successful production of LVVs in OPTIMEM with 10% FBS. Ultracentrifugation resulted in 200-fold concentration of viral vectors allowing samples to be loaded onto anion exchange columns. Following anion exchange chromatography, 90% purification was achieved resulting in a titer of 6.2x10^10 TU/ml. p24 ELISA assays suggested a vector recovery rate of 53% after chromatography.Conclusion: Based on our results, here we report a practical, optimized, scalable production of LVV suitable for laboratory scale lentiviral production.