Pre ve postimplantasyon dönemde fare embriyo gelişimini düzenleyen sinyal yolaklarinin rollerinin araştirilmasi

Abstract

Amaç: İmplantasyon zamanında embriyo, morfogenezin temelini oluşturan ve doku modellenmesini belirleyen kritik bir değişime uğrar. Çalışmanın amacı, embriyonun pre-postimplantasyon geçiş döneminde in vivo'da maternal doku içerisinde izlenemeyen morfogenetik yapılanmanın nasıl düzenlendiği sorusuna in vitro'da maternal dokular olmaksızın yanıt aramaktır. Yöntem: Bu tez çalışmasında implantasyonu destekleyici in vitro kültür sistemi kullanılmış ve literatürde ilk kez implantasyon anındaki BMP/Smad-p38MAPK sinyal aracılı hücresel yapılanma araştırılmıştır. Ayrıca, embriyonik ve trofoblast kök hücreleri ile, embriyonik ve ekstraembriyonik doku gelişimleri in vitro'da taklit edilmiş, kök-hücre kaynaklı doku ve embriyo-benzeri modeller üzerinde pre-post implantasyon geçiş döneminde gerçekleşen morfogenez araştırılmıştır. RNAi teknolojisi ve moleküler inhibitör uygulamaları kullanılarak canlı mikroskobik görüntülemeler yapılmış, doku spesifik moleküler belirteçler, kantitatif gerçek zamanlı PCR ve konfokal mikroskobi analizleri ile kapsamlı olarak araştırılmıştır.Bulgular: Smad1/5/8 sinyal inhibisyonunun Eomes ve Elf5 gibi kilit moleküler elemanların ekspresyonunu düşürüp proliferasyonu azaltarak ExE doku devamlılığını etkilediği tespit edilmiştir. Smad-bağımlı BMP sinyal inhibisyonu ayrıca, Epi dokusunda ve embriyonik kök hücrelerde Acsl4, Dll3, Fgf5 ve Otx2 ekspresyonlarını arttırarak prematüre pluripotensi faz değişimine neden olduğu ve epiblast dokusunda hücre ölümünü indüklediği bulunmuştur.Sonuç: Çalışmamızın sonuçlarında, pre-post implantasyon dönem embriyonik gelişimde ekstraembriyonik doku ve kök hücre sürdürülebilirliği için Smad-bağımlı BMP sinyal mekanizmasının direkt rol oynadığı gözlenmiştir. BMP/Smad inhibisyonu sonucunda meydana gelen moleküler defektler sonucunda yumurta silindiri oluşumunun başarısızlık ile sonuçlandığı belirlenmiştir.

Objective: At implantation, the embryo undergoes a critical transformation process which requires precise spatiotemporal control of key signalling pathways, important for morphogenesis and cell fate specification. The aim of this study is to use an in vitro approach permitting to investigate how the morphogenetic organization of the embryo become established during the transition of pre- to post-implantation which cannot be traced inside of the maternal tissue in vivo.Method: In this study, by using a protocol permitting the embryo development beyond implantation stage in vitro, the role of BMP/Smad-p38MAPK signalling events during this pre-to-postimplantation transition was investigated first time in the literature. In addition, we investigated the morphogenetic events of tissue remodelling during pre- to post-implantation transition by recapitulating the tissue formation and generating the embryo-like structures from the embryonic and trophoblast stem cells. Live imaging after using RNAi technology and molecular inhibitor applications were used, and, numerous tissue-specific molecular markers have been extensively explored with qRT-PCR and confocal microscopy analyses.Results: It has been determined that the inhibition of Smad1/5/8 decreases expression of key molecular elements such as Eomes and Elf5, thereby endangering ExE tissue continuity and decreasing proliferation. Smad-dependent BMP signaling inhibition has also been shown to induce premature pluripotency phase change by increasing expression of Acsl4, Dll3, Fgf5, Otx2 in epiblast and embryonic stem cells, and, therefore, inducing cell death.Conclusion: As a result, Smad-dependent BMP signaling mechanisms have been observed to play a direct role in the maintanence of extraembryonic tissue and stem cells during pre-to-post implantation transition. Molecular defects which occured as a result of BMP/Smad inhibition resulted in the failure of the formation of egg cylinder.