Fare embriyonik kök hücrelerin endotelyal hücrelere farklanmasında Ctcfl geninin rolü

Abstract

Amaç: CTCFL, literatürde BORİS (Brother of the Regulator of Imprinted Sites), CCCTC-bağlanma faktörü-benzeri protein ya da CTCF-T olarak ifade edilen bir proteindir. Ctcfl'in aşırı ekspresyonunun embriyogenez sırasında, vasküler bozukluklar, çoklu organ patolojileri ve neonatal ölüm ile bağlantılı olduğu ortaya konulmuştur. Bu noktadan hareketle çalışmamızda, doksisiklin ile Ctcfl gen ekspresyonunun indüklendiği fare embriyonik kök hücrelerinde (EKH), Ctcfl'in aşırı ekspresyonunun in vitro endotel yönünde farklanmada etkisinin olup olmadığının araştırılması hedeflenmiştir.Yöntem: Çalışmamızda Ctcfl transgenik ve transgenik olmayan fare EKH'leri kullanıldı. Kültür medyumuna 2 μg/ml doksisiklin ilavesi ile Ctcfl gen indüksiyonu gerçekleştirildi. Kültür sonrasında ektopik gen ekspresyonunun sağlanıp sağlanmadığı qRT-PCR ile mRNA, Western Blot ile protein düzeyinde değerlendirildi. Ektopik Ctcfl ekspresyonunun yapıldığı transgenik deney grubu ile transgen içermeyen ve gen indüksiyonunun yapılmadığı kontrol grupları çalışmaya dahil edildi. Her grup kendi içerisinde endotel yönünde farklandırılan ve farklandırılmayan şeklinde iki gruba ayrıldı. Faz-kontrast mikroskopik değerlendirme ile endotelyal hücre farklanması gruplar arasında karşılaştırıldı. Flow sitometri yöntemi ile endotelyal farklanmanın erken dönem belirteçlerinden Flk1 ve VE-kaderin proteinleri analiz edildi. Ayrıca Flk1, VE-kaderin, CD31, CD34, VEGF, Flt1 protein ekspresyonları immünofluoresan boyanma ile değerlendirildi.Bulgular: Doksisiklin ile indüklenen grupta Ctcfl gen ve protein ekspresyonları, kontrol gruplarına kıyasla anlamlı bir şekilde yüksek bulundu. Deney grupları arasında Flk1, VE-kaderin, CD31, CD34, VEGF ve Flt1 proteinlerinin ekspresyon paternleri açısından farklılık izlenmedi. Flow sitometri sonuçlarında, Flk1 ve VE-kaderin proteinleri gruplar arasında benzer ortalama fluoresan yoğunluk değerleri gösterdi.Sonuç: Bulgularımızda ektopik Ctcfl ekspresyonunun, in vitro endotel farklanmada Flk1 ve VE-kaderin ekspresyonları açısından belirgin bir etkisinin olmadığı gözlendi. Farklı belirteçler ve deney modelleri ile konunun olası moleküler mekanizmalarının aydınlatılması gerektiği kanısındayız.Anahtar Kelimeler: Ctcfl, vaskülogenez, endotelyal farklanma, embriyonik kök hücre

Objective: CTCFL is a protein called as BORIS (Brother of the Regulator of Imprinted Sites), CCCTC-binding factor-like protein or CTCF-T in literature. Overexpression of Ctcfl has been shown to be associated with vascular disorders, multiple organ pathologies and neonatal death during embryogenesis. Thus, in the present work, we aimed to investigate whether or not overexpression of Ctcfl induced by doxycycline would affect in vitro endothelial differentiation in Ctcfl transgenic mouse embryonic stem cells (ESCs).Method: Ctcfl transgenic and non-transgenic mouse embryonic stem cells were used. Ctcfl gene induction was performed by adding 2 μg/ml doxycycline to the culture media. Ectopic gene expression was confirmed by qRT-PCR at mRNA and by Western Blot method at protein level after culture. The transgenic group with ectopic Ctcfl gene expression and control groups with no transgene and no gene induction were included in the study. Each group was also divided into two subgroups that cells differentiated into endothelial cells or not. Phase-contrast microscopic evaluation was performed between groups for endothelial cell differentiation. Expression of early markers for endothelial differentiation, Flk1 and VE-cadherin, were analyzed by flow cytometry. Besides, expression of Flk1, VE-kaderin, CD31, CD34, VEGF and Flt1 proteins were assessed by immunofluorescence staining.Results: The Ctcfl gene and protein expressions in the doxycycline-induced group were found to be significantly higher than control groups. There were no differences in the expression patterns for Flk1, VE-cadherin, CD31, CD34, VEGF and Flt1 proteins between experimental groups. Flow cytometry results demonstrated that Flk1 and VE-cadherin proteins showed similar mean fluorescence intensity values in each group. Conclusion: According to our results, ectopic Ctcfl expression has no obvious effects on in vitro endothelial cells differentiation by means of Flk1 and VE-cadherin expressions. However, we believe that elucidation of potential molecular mechanisms of this phenomenon with different markers and experimental models are needed.Key words: Ctcfl, vasculogenesis, endothelial differentiation, embryonic stem cell