Normal ve metabolik olarak zorlanan preimplantif embriyoların metabolizmalarının değerlendirilmesi

Abstract

Amaç: Kliniklerde morfolojik parametrelere dayalı embriyo değerlendirmeleri yapılmaktadır. Ancak morfolojik kriterlere ek olarak kullanılabilecek ve embriyonun metabolik durumu hakkında bilgi verebilen yeni fakat invaziv girişimlerin bilinen olumsuz etkileri nedeniyle invaziv olmayan biyobelirteçlere ihtiyaç duyulmaktadır. Çalışmamızda normal ve metabolik olarak zorlanan preimplantif dönem fare embriyo metabolizmalarının, NADH ve FAD moleküllerinin otofloresan sinyallerinin invaziv olmayan FLIM ve konfokal mikroskobu ile ölçülmesi ve belirlenmesi amaçlanmıştır.Yöntem: FLIM ile NADH ve FAD ve konfokal mikroskobu ile FAD ölçümleriyle özellikle farklı besin, oksijen konsantrasyonu ve mitokondriyon bozucuları varlığında embriyo metabolizma yanıtları belirlenmiştir. Ayrıca anoksik embriyoların hangi metabolik yolağı enerji kaynağı olarak kullandığını belirlemek amacı ile Glut1 lokalizasyonu immünfloresan yöntemiyle değerlendirilmiştir.Bulgular: FLIM ile embriyo metabolizmasının farklı besin düzeyi ve oksijen koşullarına verdiği yanıtlar NADH ve FAD aracılığıyla belirlenerek embriyo metabolizma profilleri ortaya çıkarılmıştır. Konfokal mikroskobunun daha kolay uygulanabilir bir teknik olmasının avantajını kullanarak mitokondriyal belirteçlere benzeyen hatta daha seçici olan FAD ölçümü ile embriyo metabolizmasının belirlenebileceği gösterilmiştir. Ayrıca, anoksik koşullarda bölünen ve enerji kaynağı olarak oksijen bağımlı prekompaksiyon embriyoların bunu nasıl gerçekleştirdiği sorusundan doğan Glut1 sonuçlarına göre, anoksik koşullardaki erken evre embriyolarda Glut1'in ekspresyonunu arttırarak membrana yerleştiği gösterilmiştir.Sonuç: Çalışmamız sonucunda normal ve metabolik olarak zorlanan preimplantif dönem fare embriyo metabolizmalarının değerlendirilmesiyle elde edilen veriler, özellikle prekompaksiyon dönem embriyo metabolizması hakkında ilk kez detaylı bilgi sağlamıştır. Bu metabolik verilerin kullanımıyla ileriye yönelik `kaliteli embriyo seçimi` için kullanılabilecek yeni bir biyobelirteçin (örn; otofloresan FAD) oluşturulmasına ve ileri çalışmaların planlanmasına biyolojik ve teknolojik temel katkı sağlamıştır.Anahtar Kelimeler: Embriyo metabolizması, mitokondriya, NADH, FAD, mikrokosbi

Objective: Morphological assessment remains the primary method of embryo evaluation in ART. However, as a biomarker, noninvasive methods because of the well-known adverse effect of the invasive methods for assessing embryo metabolism has been needed besides morphological assessment. In our study, we aimed to determine and to measure of normal and metabolically challenged mouse embryo metabolism using FLIM and confocal microscopy via autofluorescence NADH and FAD.Method: Under different nutrient, different oxygen and mitochondrial uncoupler conditions, the response of the embryo metabolism has been determined using NADH and FAD via FLIM and using FAD via confocal microscopy. On the other hand, the expression patterns of Glut1 has been determined by immunofluorescence to reveal which metabolic pathway has been used to produce energy by anoxic embryos.Results: Embryo metabolism profiles have been revealed from the response of embryo metabolism under different nutrient and oxygen conditions using NADH and FAD via FLIM. Also, it has been showed that embryo metabolism can be measured using FAD not only other mitochondrial markers but also more selectively via confocal microscopy. Moreover, cell division of the anoxic embryos suggest a question: how these oxygen addicted precompaction embryos to produce energy could make it happen? Based on that question, we investigated the expression pattern of Glut1 and it is showed that expression of the Glut1 is increased and it is localized in the cell membrane under anoxia.Conclusion: In our study, for the first time, the detail information has been revealed about precompation mouse embryos via evaluation of the metabolism of the normal and metabolically challenged embryos. The data from our study may contribute to create a new biomarker to select the best embryo and also contribute biological and technical information for the future studies.Key words: Embryo metabolism, mitochondria, NADH, FAD, microscopy.