Beta talassemi hastalarında gen amplifikasyon ve hibridizasyon yöntemleri ile nokta mutasyonların araştırılması

Abstract

- 54 - VI- ÖZET En yaygın kalıtımsal hastalıklardan biri olan 3-talas- semiye 3-globin geni üzerindeki mutasyonlarm yol açtığı bi linmektedir. Genetik mutasyonlarm tanımlanması için ve diğer gen düzeyi çalışmalarda kullanılan gen amplif ikasyonu ve sen tetik oligonükleotid hibridizasyonu teknikleri, az materyal kullanımı, yüksek duyarlılığı ve teşhiste direkt bir yöntem olması gibi avanta jlarıyla üstün bir yere sahiptir. Bu çalışmada bir sağlıklı ve dokuz anemi veya 3-talas- semili bireylerin DNA sı incelenmiştir. Yaklaşık 5 mi periferik kan örneğinden elde edilen DNA nın 0,5 yg ı g-globin geninin ilgili bölgesini sınırlayan primerler, deoksiribonükleotidler (dNTP) ve taq polimeraz içeren bir reaksiyon karışımı içinde, 95 C de bir dakika de- natürasyon, 55 C de bir dakika hibridizasyon (primer eşleşme si) ve 72 C de üç dakika primer zincir uzaması aşamalarını içe ren 25 döngülük işleme tabi tutularak amplifiye edildi. Amplifiye DNA örnekleri, agaroz gel elektrof orezi ile kon santrasyon ayarlamaları yapıldıktan sonra naylon membran üze- 32 rine geçirilerek 5' ucundan y P dATP ile işaretlenmiş mu tasyon içeren bölgelere özgü 19 nükleotidlik (nt) ayrı tip nokta mutasyon içeren dört adet sentetik oligonükleotid prob ları ile hibridizasyona sokuldu.- 55 - Hastaların üçünde IVS-I nt 1 de G-A, ikisinde IVS-I nt 6 da T-*-C ve birinde ekson 2 kodon 39 da C-+-A nokta mutas- yonları bulunduğu saptandı. Bu hasta örnekleri hem normal hem de mutant problar ile hibridize oldukları için altı hastanın da bu mutasyonlar için heterozigot olduğu tanısı konuldu. IVS-I nt 110 da G->A mutasyonuna hiç bir hastada rastlanmadı. Kontrol olarak kullanılan örnek, bütün normal problar ile hibrize olup hiç bir mutant ile hibridize olmadı.

- 56 - VII- SUMMARY It is known that 3- thalassemia, one of the most frequently observed hereditary disorders, is caused by the mutations on 3 -globin gene. Gene amplification and synthetic oligonucleotide hybridization techniques, which are used for the identification of genetic mutations and other studies at the genetic level, are highly respected due to less material requirements, high sensitivity and being direct methods for diagnosis. In this study, the DNAs of one healthy individual and nine anemic or g-thalassemic patients were studied. The DNA was isolated from approximately 5 ml of peripheral blood and 0,5 yg of that DNA was amplied in a reaction mixture containing primers bordering related area in the g-globin gene, deoxyribonucleotides (dNTPs) and taq polymerase enzyme, by 25 subsequent cycles of denaturation at 95°C for one minute, primer hybridization at 55°C for one minute, and primer extention at 72 C for three minutes. Amplified DNA samples transferred on to nylon membrane after concentrations were adjusted by agarose gel electrophoresis, and hybridized with four different 19 nucleotides (nt) long synthetic oligonucleotide probes, containing point mutations, labelled with y32p dATP at 5' ends.- 57 It was found that three patients had G+A at IVS-I nt 1, two patients had T>C at IVS-I nt 6, one patient had C->-A point mutations at exon 2 codon 39. Since each sample hybridized both to the normal and mutant probes, these six patients were identified to be heterozygote* f or these mutations. None of the patients showedG+A mutation at IVS-I nt 110. Control sample hybridized only to normal probes and did not hybridize to any of the mutant probes.