Defibrotidin etki mekanizmasının insan kordon veni endotel hücre kültürlerinde araştırılması

Abstract

51 ÖZET Defibrotid memeli akciğerinden saflaştırılmış DNA'nın kontrollü depolimerizasyonu sonunda elde edilmiş bir polideoksiribonükleik asittir. Antitrombotik ve fibrinolitik etkileri çeşitli trombosis modellerinde kanıtlanmıştır. Kullanılan klasik antitrombosis ilaçlardan farklı olarak etkisini endotel hücrelerini modüle ederek göstermektedir. İlacın plazma tPA, PGI2 düzeylerini arttırdığı, plazminojen aktivatör inhibitörlerinin azalttığı ayrıca trombosit malondialdehit ve tromboksan B2 yapımını inhibe ettiği gösterilmiştir. Antikoagulan ve hemodinamik etkileri yoktur. İlacın etkileri endotel hücrelerini koruyucu özelliği ile birleşince trombozların önlenmesinde büyük ölçüde yarar sağlanmaktadır, ilaç hakkında tüm bilgiler klinik deneylere dayanmakta olup, etki mekanizması hakkında detaylı bilgi bulunmamaktadır. Bu çalışmada, ilacın organizma içindeki takibi ve endotel ile interaksiyonunun incelenmesini sağlayacak radyoaktif işaretlenmesi için bir yöntem önerilmiş ve hazırlanan türevin insan endotel hücre kültürleri ile etkileşmesi incelenmiştir. Endotel hücreleri göbek kordonu veninden kollejenaz ile ayrılmış ve hücreler M-199, % 20 fetal dana serum ile plastik kültür kaplarına ekilmiştir. İlacı işaretlemek için 3H-asetik anhidrid kullanılmıştır. Dioksanda çözülen 3H-asetik anhidrid Defibrotid52 ile karıştırılıp inkübe edildikten sonra sefadex G-75 kolonuna uygulanmış ve işaretlenen fraksiyonlar ayrılarak belirlenmiştir. İşaretli ilacın biyolojik aktivitesini koruduğu ve protein sentezini arttırdığı 14C-lösin deneyleri ile gösterilmiştir. Çeşitli konsantrasyonlarda ilaç içeren medium ile hücre kültürleri inkübe edilmiş, bağlanan ilaç miktarı belirlenmiş ve etkileşimin özgün olduğu ispatlanmıştır. Bağlanmanın Scatchard analizi KL= 4.2, Bmax = 5 x 107 bağlanma bölgesi/hücre değerini vermiştir. Bağlanma yerinin belirlenmesi için hücre kültürleri işaretli Defibrotid ile inkübe edildikten sonra fraksiyonlara ayrılmış ve radyoligand en çok çekirdekte bulunmuştur. Hücre zarında da önemli bir miktar ilaç bulunması, ilacın özgün bir proteine bağlandıktan sonra internalize olduğunun işareti sayılabilir.

53 SUMMARY Defibrotide is a polydeoxyribonucleotide obtained from DNA of mammalian lungs by controlled depolimerization. In various models of arterial and venous thrombosis, it has been shown that it has antithrombotic and fibrinolytic activity. Defibrotide produces its action by modulating endothelium. Drug increases tPA, PGI2 and decreases PAI plasma levels, in addition it inhibits platelet thromboxane B2 synthesis and reduces M DA. It has no anticoagulant and hemodynamic activity. With its endothelial supporting function it is a promising drug in the prevention of thrombosis. The mechanism of action of the drug is yet unknown, all the information about the drug being obtained from clinical experiments. In this study, a method for radioactive labeling of the drug and its interaction with cultured endothelial cells is proposed. Endothelial cells obtained by collagenase treatment of human umbilical cord veins were cultured with Medium 199 containing 20 % FCS, in 24 welled plastic culture dishes. 3H-acetic anhydride was used to label Defibrotide. 3H-acetic anhydride was dissolved in dioxane and mixed with Defibrotide. Mixture was applied to Sephadex G-75 column and fractions containing the labeled drug identified and used in binding experiment. 14C-leucine incorporation experiments were done to show that labeled drug has biological activity and increases protein synthesis. Binding experiments54 were carried out by incubating cell cultures with media containing various concentrations of labeled Defibrotide and determining the amount of drug bound to cells. The Scatchard analysis of the obtained data established the presence of a spesific binding site with KL of 4.2 >ug/ml and Bmax of 0.34 yug/2 x 105 cells. To identify the location of binding of Defibrotide cell cultures which were incubated with labeled drug were fractionated by centrifugation. Our results suggest that the major location of 3H Defibrotide in endothelial cells is the nucleus. Plasma membranes also contain a considerable amount of the drug suggesting a mechanism where binding to a protein is followed by internalization.