Normal ve aterosklerozlu olguların trombositlerinde gamma glutamil transferaz aktivitesi

Abstract

42 - V- ÖZET Bu çalışmamızda çeşitli hücre ve vücut sıvılarında bu lunmuş olan y-GT'nin trombositlerde varlığını göstermeye ça lıştık. Bu amaçla 4 kez dondurulup eritilen trombositler % 1 Triton X100 ile muamele edilip, solubilize membran fraksiyo nunda Y-GT aktivitesi ölçüldü. Kromojenik substrat olarak y-glutamil-p-nitroanilid akseptör olarak da glisilglisin kul lanıldı. Trombosit glutatyon düzeyleri de 5,5' ditiyobis 2- nitro benzoik asit kullanılarak ölçüldü. Normal kişilerde (n:10) trombosit Y-GT düzeyleri 35,67±3,01 mU/10 trombosit, glutatyon düzeyleri ise 11,65±1,41 Ug/10 trombosit olarak, aterosklerozluların (n:12) Y-GT düzeyleri 18,66±2,86 mU/109 9 trombosit, glutatyon düzeyleri Il,70±lj55 Ug/10 trombosit olarak bulundu. Normal ve ateroklerozlu kişilerin trombosit Y-GT` si arasında anlamlı bir fark gözlendi. Ancak glutatyon düzeylerinde değişiklik görülmedi. Trombositlere soğuk ozmotik şok yaptığımızda Y.-GT'nin ozmotik şok sıvısına geçmediğini, Y-GT aktivitesinin trombosit pelletinin Triton X100 ile solubilizasyonu sonucu tesbit et tiğimizi gördük. Trombosit ozmotik şok çalışmalarında glikoz, lösin, histidin bağlayıcı proteinlerin ozmotik şok sıvısına geçtiği bildirilmiştir. Bu nedenle Y-GT'nin trombosit amino asit transportunda aktif olarak yer almadığını düşünmekteyiz.- 43 - Ayrıca Y-GT'nin molekül ağırlığı SDS-GH gel (% 5) elektroforezi ile 75.358 olarak tesbit edildi. HPLC'de ise molekül ağırlığı 145.454 olarak bulundu. Bu değer indirgenmiş şartlarda çalışıldığından molekül yapısının etkisi altında hakiki molekül ağırlığını göstermemektedir. Trombositlerden y-GT'nin kısmi saf laştırılmasını sağ lamak amacıyla yaptığımız çalışmada spesifik aktivite Sephadex G-200'den sonra başlangıca oranla 2.6 kez artmıştır.

- 44 - VI- SUMMARY In this work, y-glutamyl transferase ( y-GT) activity and glutathione in the platelets of normal subjects and atherosclerotic patients is determined and partial purification of platelet y-GT is established. Washed platelets were frozen and thawed for 4 times and solubilized with 1% Triton X-100. The y-GT activity was measured in solubilized membrane fractions using y-glutamyl- p-nitroanilid as the choromogenic substrate and glysyl-glycine as the acceptor molecule. 5, 5 ' -dithiobis 2-nitrobenzoic acid was used for glutathione determinations. The platelet y-GT activities were 35.67±3.01 mU/10 platelets (n:10) and 18.66± 2.86 mU/10 platelets (n:12) for normals and atherosclerotics, respectiely. The difference was highly significant. The platelet glutathione levels were found to be 11.65±1.40 ug/ 109 platelets (n:10) and. 11. 70±1. 55 ug/109 platelets (n:12) for normals and atherosclerotics respectively. No difference was detected in platelet glutathione levels between normals and atherosclerotics. The cold osmotic shock to platelets did not cause release of y-GT. ' y-GT activity was detected in the Triton X. 100 solubilized membrane fraction of the shocked platelet membrane fraction release of glucose, leucine and histidine- 45 - binding proteins in to the shock fluid responsible forthe membrane transportwasjreportedpreviouslyin the literature. Therefore y-GT is an integral membrane protein of platelets and it is not responsible for the amino acid transport directly. Platelet y-GT was partially purified (2.6 times) by 100% cut (NH-)2S0, precipation and Sephadex G-200 column chromatography. The molecular weight of partially purified Y-GT was determined by SDS-6H-PAGE (5%) as 75.358 and by isocratic HPLC as 145.454 under unreduced conditions where shape of the molecule is also effective.