Brassica olerecea var. acephala (kara lahana) ekstresinin biyolojik aktiviteleri ve biyokimyasal yönden incelenmesi

Abstract

76 ÖZET Brassica oleracea var. acephala yapraklarının suyundan petrol eteri, eter, etil alkol ekstraksiyonu ve A1203 kolon kromatografisi ile elde edilen bir ekstrenin antitümöral etkisi in vivo olarak Mus musculus Balb/c farelerinde oluşturulan katı ve sıvı Ehrlich ascites tümörüne (EAT) etkisi ile gösterildi. Farelerde oluşturulan katı EAT'lerin 25 hayvanın 25 günlük 20 mg ekstre/0.5 mi serum fizyolojik (SF) (i.p) ile tedaviden sonra % 5^'sinin tamamiyle iyileştiği, % 24'ünde tümörün küçül düğü, % 4'ünde tümör büyüklüğünün sabit kaldığı ve % 16'sında tümörün geliştiği SF verilen kontrol grubunda 18 farenin hepsinde tümör geliştiği görüldü. 15 gün süreyle ekstre verildikten sonra tümör transplantasyonu ancak 30 farenin 3'ünde başarılı oldu. Kontrol grubunda 30 farenin 19'unda tümör gelişti. Ekstrenin sıvı EAT gelişmesini de önlediği gözlendi. Farelere kg başına 20 mg-500 mg ekstre SF içinde (0.5 mi) intraperitoneal olarak verildiğinde ve sıçanlara 80 mg/0.5 mi SF i.v. olarak verildiğinde toksik olmadığı gözlendi. Ayrıca bu ekstre in vitro olarak hemostatik parametrelere etkisi yönünden de değerlendirildiğinde ekstrenin doza bağımlı olarak ADP ile oluşan trombosit agregasyonunu (1. ve 2. dalga) inhibe ettiği euglobulin erime zamanını 133±17 dakikadan 1 18± 13 dakikaya indirerek (n:12) fibrin plakda 6.8010.86 cm2 lik eritme alanı vererek fibrinoli- tik sistemi (n:27) aktive ettiği, trombin zamanının ise 11.40+1.93 sani-77 yeden 16.65±2.17 saniyeye yükselterek antitrombinik etki de gösterdiği tesbit edildi (n:20). Ekstre Htc değerlerinde in vivo hiç bir değişiklik yapmadı. İn vivo olarak eritrositlerde gluttayonu 1.38±0.37 mmol GSH/gHb den 0.95±0.16 mmol GSH/gHb ye düşürdüğü, Hb ni 12.03±2.52 gHb/dl den 20.58±2.55 gHb/dl'e yükselttiği (n:15) ve glutat- yon peroksidazı (GPX) 40.33±8.12 U/l den 22.17±5.17 U/l'ye düşürdü ğü görülmüştür (n:8). Solid EAT li farelerin (n:14) eritrositlerinde glu- tatyon düzeyi 0.15±0.02 mmol GSH/gHb, hemoglobin düzeyi 10.79±1.06 Hb g/dl ve GPX 39.75+14.15 U/l olduğu saptanmıştır (n:8). Ekstre in vivo olarak plazma protein konsantrasyonunu 15 günde 40.01±1.72 mg/ml den 52.62±5.44 mg/ml ye çıkardığı (n:10) görülmüş ve tümörlü farelerde total plasma protein konsantrasyonu 46.06+1.45 mg/ml olarak bulunmuştur (n:10). Plazma protein dağılımı incelendiğinde (DAVIS-- PAGE) gel dansitometresinden elde edilen diyagramlarda 17 protein piki görüldü. Ekstre tatbikinden sonra 1. pikte (albümin) artma, 12., 13. ve 17.piklerdeki (7-globulinler kısmında) artmalar anlamlı bulundu (n:7). Plazma protein dağılımı izokratik HPLC ile incelendiğinde 55000 Da molekül ağırlığında bir proteinin normalde bulunmadığı, in vivo eks tre verilmesiyle ortaya çıktığı ve tümörlü farelerde de bulunduğu, ekstre ile tedaviden sonra kaybolduğu bulgularımız arasındadır (n;7). Ekstrenin kısmi analizinde glukoz, L-triptofan, indol türevi bir madde ve 4 protein bulunmuştur. Kara lahana ekstresinin SDS-PA- GE analizinde görülen proteinlerin molekül ağırlıkları 10.000 Da, 17.000 Da, 52.000 Da, 66.000 Da'dır. Proteinler (% 95 kesitli) (NH4)2S04 ile çöktürülerek diyaliz yapıldığında SDS-PAGE analizi sonucu molekül ağırlıkları 9.500 Da, 15.500 Da, 55.000 Da, 66.000 Da olan 4 protein görüldü. Ekstre asetonla çöktürüldüğünde 63.000 Da molekül ağırlıklı tek bir protein bandı görüldü ve Ekstre-As'ın fibrin plakların da eritme alanı gösterdiği tesbit edildi.

78 THE BIOLOGICAL ACTIVITIES AND THE BIOCHEMICAL EFFECTS OF AN BRASSICA OLERACEA VAR. ACEPHALA (BLACK CABBAGE) EXTRACT SUMMARY The in vivo antitumoral effect of the extract isolated from the juice of Brassica oleracea var. acephala leaves by petroleum ether, ether, ethylalcohol extraction and A1203 column chromatography was shown on the Mus musculus Balb/c mice with solid or liquid Ehrlich ascites tumors (EAT). Out of 25 mice with solid EAT, after 25 days of treatment with 20 mg extract in 0.5 ml saline each day intraperitoneal^, in 5$% of the animals the tumor completely disappeared, in 24% the tumor sizes decreased, in 4% tumor sizes were fixed and in 16% tumor sizes were increased. In the control group animals (n:18) all the tumor sizes were increased. Upon the administration of the extract for 15 days before tumor transplantation, out of 30 mice only 3 had tumor formation whereas in the control group 19 had tumor formation out of 30 mice. Also the extract prevented liquid EAT formation. The extract was nontoxic either when administered intraperitoneal^ to mice at 20 mg to 500 mg concentrations or when administered i.v. to rats at 80 mg concentration of the extract. This extract was also tested for it effects on hemostatic parameters. It caused concentration dependent inhibiton of both primary and secondary platelet aggregation induced by ADP. It79 decreased euglobulin lysis time from 133.25+16.69 min to 118.30±13.22 min (n:12) and it caused 6.80±0.86 cm2 (n:27) lysis area on fibrin plates, showing the extract's effect on the activation of fibrinolytic system. It had thrombinik effect by increasing the thrombin time from 11.40 + 1.93 sec to 16.65 + 2.17 sec (n:20). It caused no change on hemotocrite levels. In vivo administration of the extract for 15 days caused decrease in erythrocyte glutathione level from 1.38±0.37 m mole GSH/gHb to 0.95±0.16 mmole GSH/gHb (n:15), increase in hemoglobin level from 12.03±2.52 gHb/dl to 20.58±2.55 g Hb/dl (n:15), decrease in glutathione peroxidase level from 40.33±8.12 U/l to 22.17±5.17 U/l (n:8). The mice (n:10) with solid EAT had erythrocyte glutathione, hemoglobin and glutathione peroxidase levels as 0.15 m mole GSH/gHb, 10.79±1.06 Hb g/dl and 39.75±14.15 U/l, respectively. The extract caused increase in plasma protein level after 15 days treatment, from 40.01±1.72 mg/ml to 52. 6215.44 mg/ml (n:10). In the mice with solid EAT, the plasma protein level was 46.06il.45 mg/ml (n:10). When plasma protein distribution was examined with DAVIS-PAGE, 17 protein peaks were detected in the gel dansitometer diagrams. After extract treatment for 15 days increases in the l.peak (albumin) 12., 13. and 17. peaks were detected. 12., 13. and 17. peaks corresponded to gamma globulin peaks (n:7). The plasma, protein distribution was also examined with isocratic HPLC. A k55 Da protein was detected with the 15 days extract treatment and in the plasma of the mice with solid EAT. This protein disappeared in the mice which were treated with the extract. Partial identification of the extract showed presence of an indole containing compound, L-tryptophan, glukoz and 4 proteins with 10 kDa, 17 kDa, 52 kDa, 66 kDa. The 95% cut (NH4)2S04 precipitation of the extract and dialysis gave 9.5 kDa, 15.5 kDa, 55 kDa, and 66 kDa proteins. After asetone precipitation of the extract only one protein was isolated with a molecular weight of 63 kDa. This Extract-As caused lysis on both heated and unheated fibrin plates.