Asit sıvısından protrombinin saflaştırılması

Abstract

6. ÖZET Karaciğer hastalıklarında protrombinin fizyolojik aktivitesinde azalmaya yol açan sebebler spekülatifdir.Moleküler düzeyde inceleme yapılabilmasi için bunun saf olarak elde edilmesi gerekir. Bu amaçla sirozlu bir olguya ait 1130 ml asit sıvısından baryum sitrat adsorbsiyonu, amonyum sülfat elüsyonu, DEAE Sephacel ve Heparin Sepharose CL-6B kolon kromatografisi kullanılarak 6,7 mg protrombin saflaştırıldı.Bu, SDS-PAGE ile tek bant olarak görüldü. Elektroforetik mobilitesi normal plazma havu zundan elde edilen protrombin ile aynıydı. Molekül ağırlığı 70200, faktör II eksik plazma kullanıldığında spesifik aktivitesi 3,36 U/mg, stafilokoagülaz kullanıldığında ise 28,9 U/mg olarak bulundu. Normal plazma protrombinine ait, 3,92 U/mg, 30,1 U/mg değerleri ile karşılaştırıldığında, stafilokoagülaz ile aktivasyonda normale yakın ama faktör II eksik plazma kullanıldığında daha düşüktü. Kalsiyumlu ve kalsiyumsuz ortamda immünelektroforezde normalden farklılık görülmedi. `Cross` immünelektrofo rezde normalde olduğu gibi tek pik saptandı. Baryum sitrat adsorbsiyonundan sonra geriye kalan asit sıvısında başlangıçtaki nin % 1' inden daha az protrombin aktivitesi (stafilokoagülaz ile) kaldı. Bu protrombi nin kısmi saflaştırılması DEAE Sephacel ve Heparin Sepharose CL-6B kolon kroma tografileri ile yapıldı. Elde edilen ürün selüloz asetat elektroforezinde beta bölgesinde tek bant verirken, SDS-PAGE' de bant sayısı çokdu. Adsorbsiyon sonrasında asit sıvısında kalan bu protrombinin daha ileri saflaş tırılmasının afinite kromatografisiyle mümkün olabileceği düşünülebilir. Normal ve anormal protrombinin immünolojik özelliklerinin benzerliği göz önünde tutularak, bu çalışmada, normal plazmadan saflaştırılan protrombine karşı elde edilecek antiserumla afinite kolonu hazırlanabilir. Asit sıvısından baryum sitrat adsorbsiyonu ile elde edilen protrombinin normal protrombinle karşılaştırılması bu çalışmada çok kısıtlı olarak yapılmıştır. İleride, adsor- 46be edilmiş asit sıvısındaki protrombin afinite kromatografisi ile saflaştınldıktan sonra bununla, bu çalışmada elde edilen asit ve normal plazma kaynaklı saf protrombinlerin karşılaştırılması, bir çok soruya açıklık getirebilir. Ayrıca asit sıvısı çeşitli proteinlerin saflaştırılmasında kaynak olarak kullanılabilinir. 47

7. SUMMARY The Purification of Prothrombin From Ascites Fluid The reasons of the decreased functional activity of prothrombin in the liver di sease have yet been speculative. It could be possible to study on molecular basis the reasons of prothrombin abnormalities when a highly purified preparation of prothrom bin from a patient with liver disease is available. In this study, prothrombin (6,7 mg) was purified from the ascites fluid (1130 ml) of a patient with liver cirrhosis by barium citrate adsorption, ammonium sulphate elu- tion, DEAE Sephacel and Heparin Sepharose CL-6B column chromatography steps. This purified prothrombin migrated as a single band on SDS-PAGE and its electropho- retic mobility was same as the prothrombin isolated from normal pooled plasma. The specific activities were found to be 3,36 U/mg in the one stage clotting assay and 28,9 U/mg in the staphylocoagulase /chromogenic substrate assay when normal prothrombin had 3,92 U/mg and 30,1 U/mg specific activities respectively. After barium citrate adsorption, less than 1% of nonphysiological total proth rombin activity in the initial ascites fluid was retained in the adsorbed ascites. This too small amount of prothrombin was partially purified by DEAE Sephacel and Heparin Sepharose CL-6B column chromatography steps. This prothrombin migrated as a single band in beta-region on sellulose acetate electrophoresis, but it was found to be hetero genous by SDS-PAGE. Since the immunological behaviors of normal and abnormal prothrombins are similiar, the prothrombin isolated from normal pooled plasma in this study, may be used to obtain antibody required to prepare affinity column for high purification of the prothrombin from adsorbed ascites. In this study some limited properties of the proth rombin isolated via barium citrate adsorption were investigated. An extensive study to compare the characteristics of these three proteins, normal prothrombin, the prothrom bin from ascites via barium citrate adsorption and the prothrombin from adsorbed asci tes may be useful to explain the reasons of the decreased functional activity of proth rombin in the liver disease. 48