Defibrotid fraksiyonlarının fibrinolitik ve antitrombotik aktivitelerinin incelenmesi

Abstract

ÖZET Defibrotid, endotel hücre fonksiyonlarını modüle ederek profibrinolitik ve antitrombotik etki gösteren bir ilaçtır. İlaç endotel hücrelerden doku plazminojen aktivatörlerini (tPA) ve prostasiklin (PGI2) sentezini arttırırken plazminojen aktivatör inhibitörlerini (PAI) sentezini azaltır. Defibrotid memeli dokusundan ekstrakte edilen molekül ağırlıkları 15-30 kD arasında değişen tek iplikli polideoksiribonukleotid tuzudur. Elektroforetik ve kromotografik çalışmalar defibrotidin çeşitli uzunluktaki DNA fragmentlerinin karışımı olduğunu göstermektedir. Defibrotidin farklı fraksiyonlarının farklı spesifik etkilerden sorumlu olabileceği düşünülmektedir. Bu çalışmada, defibrotid Sephadex G-75 kolon kromatografisinden geçirilerek molekül ağırlıklarına göre fraksiyonlarına ayrıldı. Öncelikle defibrotid ve fraksiyonlarının doğrudan ve endotel bağımlı fibrinolitik etkisi incelendi. İlaç ve fraksiyonlarının doğrudan plazmaya ilave edilmesi, plazmanın euglobulin erime zamanını (ELT) kontrola kıyasla değiştirmediği saptandı. Defibrotid ve fraksiyonları insan göbek kordon veninden hazırlanmış endotel hücre kültürü ile 1 ve 24 saat inkübe edildi. Inkübe edilmiş kültür medyumlarının plazmanın euglobulin erime zamanı (ELT) üzerine etkileri araştırıldı. Defibrotid ve büyük molekül ağırlıklı fraksiyonun ELT yi kısalttığı (p<0.001), küçük molekül ağırlıklıların ise ELT yi etkilemediği saptandı. Defibrotidin antitrombotik etkisinden sorumlu fraksiyonu saptamak amacı ile defibrotid ve fraksiyonları ile 1 ve 24 saat inkübe edilmiş medyumlarda dayanıklı prostasiklin (PGI2) metaboliti olan 6-keto prostaglandin F1a (6-keto PGF 1a) düzeyleri tayin edildi. 1 Saatlik inkübasyonda defibrotid ve fraksiyonları 6-keto PGF 1a salınmasını defibrotid içermeyen kontrol medyumuna kıyasla anlamlı düzeyde arttırmadığı, 24 saatlik inkübasyonda büyük molekül ağırlıklı fraksiyonun ise 6-keto PGF1a salınmasını anlamlı düzeyde arttırdığı saptandı (p<0.001). 31Küçük moleküllü fraksiyonların 6-keto PGFlot salınması üzerine etkisi tespit edilemedi. Çalışmamızın sonunda büyük molekül ağırlıklı defibrotid fraksiyonunun maksimum fıbrinolitik ve uzun süreli antitrombotik aktiviteden sorumlu olduğu ve ilacın endotel doku üzerinden etki gösterdiği saptandı. 32

SUMMARY Defibrotide is an profibrinolytic and antithrombotic drug which modulates endothelial function. The drug increases tissue plasminogen activator (tPA) and prostacyclin (PGI2) and decreases plasminogen activator inhibitor (PAI) synthesis of endothelial cells. Defibrotide ıs a deoksırıboucleotıc acid denvanve extracted from mammalian tissues. It is the sodium salt of single stranded polydeoksiribonucleotid of mw 15 to 30 kD. Electrophoretic and chromatographic analysis demostrated that defibrotide is a mixtures of DNA fragments of various lengths. It is possible that different fragments of defibrotide may be responsible for the different spesific effects. In this study first, we fractionated defibrotide by Sephadex G-75 column chromatography and investigated direct and endothelium dependent fibrinolytic effect of major fractions on euglobulin lysis time (ELT). Addition of defibrotid and its fractions to human plasma samples directly before separating the euglobulin fraction did not change ELT of plasma samples. Cultured human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) were incubated with defibrotide and its fractions at concentration of 100 j.g/ml for 1 and 24 hours respectively. Addition of incubation medium to plasma shortened euglobulin lysis time (ELT) but each fraction at different extend. The high molecular weight fraction being the most effective shortened ELT significantly (p<0.001) where as the fraction with the lowest molecular weight did not have any significant effect on ELT compared to controls. The data demostrated that highest molecular weight has the maximum fibrinolytic effect. N For detection of the fraction responsible for the antithrombotic effect of defibrotide we measure 6-keto prostaglandin F1a level (6-keto-PGF1 a stable metabolite of prostacyclin) at the incubation medium. Incubation of HUVEC with defibrotide and its fractions for 1 hour did not stimulated PGI2 synthesis compare to the control istatistically. Whereas, 24 hours incubation with the highest molecular weighted fraction which stimulated PGI2 synthesis significantly 33(p<0.001). Intermediate fractions effect the PGI2 level at distinct extend (p<0.05), while the lowest fractions did not effect PGI2 levels compare to control Results of our experiments show that defibrotide fraction with the highest molecular weight has the highest fibrinolytic and longer anthitrombotic activity with an endothelium dependent mechanism. 34