İnsan trombosit gamma-glutamil transferazın karakterizasyonu

Abstract

Gamma glutamil transferaz (GGT) glycoprotein yapısmda bir membran proteinidir. GGT gamma-glutamil artıklarının amino asitlere, dipeptidlere ve suya transferinde, gtutatyon metabolizmasında ve LTC4'ün LTD/j'e dönüşümünde rol alır. Bu çalışmada GGT insan trombositlerinden Triton X-100 ile solubiüze edilerek karakterize edildi. Kinetik çalışmalar için 7 normal kişiden alman kanlardan elde edilen trombosit havuzu kullanıldı. Substrat gamma- glutamil p-nitroanilid için Vmax: 100 mU/lO^ Trombosit, Km: 2.08 mmol/L olarak, akseptör glisüglisin için Vmax : 45.45 mU/lO^ Trombosit, Km : 15.87 mmol/L olarak saptandı, insan trombosit GGT'sinin optimum pH'sı 8.2, optimum temperatür 37 1 olarak gözlendi Enzimin 56°C de termal stabilitesi ölçüldüğünde 30 dakika inkübasyonu takiben aktivitenin %36 oranında azaldığı tespit edildi Inhibitor çalışmaları sonucunda borat varlığında L-serinin enzimin kompetetif inhibitörü olduğu ve 5 mmol/L L-serin konsantrasyonunda GGT aktivitesinin %93 inhİbe olduğu görüldü. L-serin için inhibitor sabiti (Kj) 30 umol/L olarak hesaplandı. Bromkresol yeşilinin ise enzimin nonkompetetif inhibitörü olduğu ve O.lmmol/L konsantrasyonda GGT aktivitesini %34 inhibe ettiği gözlendi Enzimin transfer reaksiyonu için ping pong mekanizmasını kullandığı saptandı Trombosit GGT'si, Triton X-100 ile solubilizasyon, gel filtrasyon, iyon değiştirici kromatografi afinite kromatografi yöntemleri ile başlangıca oranla 10 kez saflaştinldı. Poliakrilamid gel elektroforezi (PAGE) ile trombosMerde GGT'nin tek bir izoenziminin olduğu saptandı.

Gamma- glutamyl transferase (GGT) is a membrane glycoprotein which is involved in the transfer of gamma glutamyl residues to amino acids, to dipeptides and to water, in glutathione metabolism and in formation of LTD4 from LTC4 of the leucotriens. In this work GGT was solubilized with Triton X-100 from human platelet membranes and was characterized. Kinetic studies were performed in pooled platelets of 7 normal subjects. For gamma glutamyl p-nitroanilide as the substrate, Vmax was 100 mU/ 10^ pits and Km was 2.08 mmol/L. For grycylglycine as the acceptor, Vmax was 45.45 mU/10^ pits and Km was 15.87 mmol/L. Its optimum pH and optimum temperature were 8.2 and 37°C, respectively. The thermal stability tests showed 36% GGT activity decrease after 30 min incubation at 56° C. In the presence of borate, L- serine was found to be competitive inhibitor and GGT activity was inhibited 93% with L-serine at a concentration of 5 mmol/L. Inhibition constant (Kj) was calculated as 30 umol/L for L-serine. Bromcresol green was a noncompetitive inhibitor and enzyme was inhibited 34% with bromkresol green at a concentration of 0. 1 mmol/L. GGT showed ping pong mechanism for transfer reactions. Only one isozyme was observed through poryacrylamide gel electrophoresis (PAGE). GGT was purified 10 times by Triton X-100 solubilization, gel filtration, ion exchange chromatography and affinity chromatography.