Liquidambar orientalis mill. var. orientalis`in antioksidan, anti-karsinojenik, anti-inflamatuvar ve apoptotik etkilerinin hücresel ve moleküler düzeyde araştırılması

Abstract

L.orientalis'in balsam, yaprak ve meyvelerinden farklı polariteye sahip ekstreler hazırlanarak, bu ekstrelerin insan kolon kanser hücre hatları olan HCT-116 ve HT-29 hücreleri üzerindeki antioksidan, anti-proliferatif, apoptotik ve anti-inflamatuvar etkileri araştırılmıştır. Sitotoksisite testi XTT metodu ile gerçekleştirilmiş ve HCT-116 hücre hattında 27.80 μM, HT-29 hücre hattında ise 43.13 μM IC50 dozu ile L.orientalis'in yapraklarından hazırlanan metanollü ekstrenin en etkili ekstre olduğu bulunmuştur. Bu sonuçlar biyolojik aktivite analizlerini de desteklemektedir. Diğer deneyler bu IC50 dozları üzerinden gerçekleştirilmiştir. L. orientalis yaprak metanol ekstresinin kromatografik analizinde; gallik asit, kersetin, epigallokateşin, 3,4-dihidroksibenzoik asit, klorojenik asit, ferulik asit, mirisetin, kemferol, luteolin başta olmak üzere çeşitli biyoaktif maddelere rastlanmıştır. Pek çok hücresel sürecin sıkı bir şekilde düzenlenmesinde rol alan ve birçok kanser türünde aberant olarak eksprese edilen, NF-κB sinyal yolağı ile ilişkili 88 gen ve apoptozla ilişkili 9 genin ekspresyon seviyeleri gerçek zamanlı PZR ile araştırılmıştır. Her iki hücre hattında da NF-κB sinyali ile ilişkili olan ve ekspresyon artışı gözlenen genlerin IL-10, kaspaz 1 (CASP1), kaspaz 8 (CASP8), TNFAIP3, TNFRSF10A ve TNFRSF10B; ekspresyon azalışı gözlenen genlerin ise IL-6, IL-8, NFKB1, TNF, TLR2 ve IKBKB olduğu saptanmıştır. Ayrıca apoptozla ilişkili p53, Bax, kaspaz -3, -7, -8, -9, Fas, sitokrom c (Cycs) genlerinin ekspresyonlarında kontrol göre artış ve anti-apoptotik Bcl-2 geninde ise azalış gözlenmiştir (p<0.05). Bu genlerin dışında hücreye özgü artış ve azalış gösteren genler de incelenerek NF-κB yolağı aracılı anti-proliferatif ve apoptotik etki mekanizması açıklanmıştır. Apoptozun morfolojik ve biyokimyasal olarak incelenmesi TUNEL testi ve akış sitometrisi ile gerçekleştirilmiş ve ekstrenin apoptozu uyardığı gösterilmiştir. Ekstrenin invazyon karşıtı etkisinin olup olmadığı matrijel invazyon testi ile değerlendirilmiş ve kontrole göre ekstrenin her iki hücre hattında da invazyonu önemli ölçüde baskılayarak anti-invaziv özellik sergilediği belirlenmiştir. Her iki hücre hattında ekstrenin anti-inflamatuvar aktivitesinin belirlenmesi için hücreler TNF-α ile uyarılmış, ortama salınan sitokinlerin (IL-6, IL-8, IL-10) seviyeleri ELISA testi ile ölçülmüştür. Hücrelerin sitokinlere verdiği cevapların farklı olduğu ve IL-6 ve IL-8 seviyesinin HT-29 hücre hattında, IL-10 seviyesinin ise HCT-116 hücre hattında daha iyi baskılandığı gözlenmiştir. Bu durum ekstrenin her iki hücre hattında da etkili olduğunu göstermektedir. Metastazla ilişkili bir sitokin olan IL-8'in HT-29 hücre hattında daha fazla baskılanması, ekstrenin hücreyi duyarlı hale getirerek TNF-α'nın sitotoksik etkisini artırmış olabileceğini düşündürmüştür. Elde edilen sonuçlara göre L.orientalis yaprak metanol ekstresinin HCT-116 ve HT-29 hücrelerinin çoğalmasını hücresel ve moleküler seviyede inhibe ederek NF-κB aracılı anti-proliferatif ve apoptotik etki gösterdiği bulunmuştur.

For the assesment of antioxidant, anti-proliferative, apoptotic and anti-inflammatory effects on HCT-116 and HT-29 cells, extracts in different polarities from balsam, leaves and fruits of L. orientalis were prepared. The cytotoxic activity of the extracts of L. orientalis was investigated through XTT assay. The methanol leaf extract showed the highest effect (IC50 values for HCT-116 and HT-29 cell lines were determined to be 43.13 μM and 27.80 μM, respectively). These results also supported biological activity analyzes. Next steps of the study were performed at these IC50 doses.Chromatographic analysis on L. orientalis methanol leaf extract revealed the presence of vairus bioactive substances, especially gallic acid, quercetin, epigallocatechin, 3,4-dihydroxybenzoic acid, chlorogenic acid, ferulic acid, myristine, kaempferol and luteolin. Expression levels of 88 genes associated with the NF-κB signaling pathway and 9 genes associated with apoptosis, which involved in regulation of many celular processes and aberantly expressed in many cancers, were investigated by real time PCR. Results showed a marked increase in the expression of IL-10, Caspase 1, Caspase 8, TNFAIP3, TNFRSF10A and TNFRSF10B and decreased in the expression of IL-6, IL-8, NF-kB, TNF, TLR2 and IGFBP, in both cell lines. Additionally, there was also an increase in expression of apoptosis-associated p53, Bax, Caspase-3, -7, -8, -9, Fas and Cycs genes and a decrease in anti-apoptotic Bcl-2 gene (p<0.05). There were also genes that showed an expression increase and decrease in the cell-spesific manner (only in HCT-116 or only in HT-29 cell line). The NF-κB pathway mediated anti-proliferative and apoptotic mechanism of the action has been described, including all these genes. TUNEL assay and Flow Cytometry were used for morphologically and biochemically detection of apoptosis. The results of both methods have shown that L. orientalis leaf methanol extract stimulates apoptosis in the both cell lines. The effect of the extracts on invasion determinated via Matrigel Invasion assay, in which L. orientalis leaf methanol extract significantly supressed invasion in the both cell lines compared to the untreated cells (p<0.05).For the evaluation of anti-inflammatory effect of L. orientalis extracts in both cell lines, first the cells were stimulated with TNF-α, then levels of cytokines (IL-6, IL-8, IL-10) released to media were measured by the ELISA assay. It was observed that the responses of the cells to the cytokines were different, i.e. IL-6 and IL-8 were better supressed in the HT-29 cell line and IL-10 was better supressed in the HCT-116 cell line. This suggests that the extract is effective on both HCT-116 cells and HT-29 cells. Further supression of the metastasis-associated cytokine, IL-8, in the HT-29 cell line has been suggested that the extract could probably enhance the sensitivity of the cells and increase the cytotoxic effect of TNF-α.In conclusion, L. orientalis leaf methanol extract inhibits the proliferation of HCT-116 and HT-29 cells at cellular and molecular levels and exerts NF-κB mediated anti-proliferative and apoptotic effects.