Doğal Öldürücü (NK) Hücre Düşüklüğü Olan Hastalarda, NK HücreSitotoksitelerinin ve FcγRIIIA Gen Mutasyonlarının Araştırılması

Abstract

Doğal öldürücü hücreler (natural killer, NK), organizmayı enfeksiyonlara ve kansere karşısavunmada önemli rol oynayan hücrelerdir. NK hücrelerini organizmada iki önemli görevibulunmaktadır. Bunlardan birincisi, enfeksiyona neden olan mikroorganizmalara karşı direktsitotoksik etki, ikincisi ise FcγRIIIA geni aracılığıyla gerçekleşen antikor bağımlı hücresel sitotoksisite(ADCC)'dir. NK hücrelerinin sayı veya fonksiyonunda bozukluk(lar), NK hücre eksikliği/bozukluğu(NKD) olarak adlandırılmaktadır. Bu çalışmada, klinik olarak NKD düşünülen hastalar NK hücre altgrupları, NK hücre sitotoksisitesi ve FcγRIIIA gen mutasyon(lar)u açısından araştırılması ve klinik,laboratuvar ve fonksiyonel analiz sonuçları ile FcγRIIIA gen mutasyon(lar)u arasındaki ilişkinindeğerlendirilmesi amaçlandı.Çalışmaya Necmettin Erbakan Üniversitesi Meram Tıp Fakültesi Çocuk Allerji veİmmünoloji polikliniğine ilk defa başvuran hastalar ile daha önceden takipli 10 hasta ve 7 sağlıklıbireyden oluşan kontrol grubu dahil edildi. Tüm hasta ve kontrol kan örneklerinden, periferik kanlenfosit oranları ve NK hücre alt grupları oranları akım sitometri yöntemiyle, NK hücrelerininfonksiyonları ise sitotoksisite testi ile değerlendirildikten sonra yeni nesil dizileme yöntemi ileFcγRIIIA gen mutasyonları araştırıldı.Periferik kan akım sitometri yöntemi ile değerlendirilen NK hücre alt grup analizindeCD56brightCD16neg, CD56brightCD16int ve CD56dimCD16hi olmak üzere 3 farklı NK hücre alt grububelirlendi. Hastaların NK hücre alt grupları kontrol grubu ile karşılaştırıldığında CD56brightCD16neghücre oranında statistiksel olarak anlamlı bir farklılık tespit edilmedi. CD56brightCD16int veCD56dimCD16hi hücre oranları kontrol grubu ile karşılaştırıldığında hastalarda anlamlı derecede düşükolduğu tespit edildi. NK hücre sitotoksisitesi, K562 lizisine bağlı yöntem ile değerlendirildi. NK hücresitotoksisite analizi sonucunda hasta ile kontroller arasında K562 miktarındaki oransal olarakazalmanın istatistiksel olarak anlamlı olduğu tespit edildi (p<0,001). Hastalardaki K562 hücre azalmaoranı kontrollere kıyasla istatistiksel olarak daha az azaldığı tespit edildi. Yeni nesil dizileme yöntemiile FcγRIIIA geninin tüm exom analizinde, ekzon 4 (rs396991) ve ekzon 3 (rs10127939)'depolimorfizmler olduğu belirlendi. Ayrıca dizileme sonucunda FcγRIIIA ile FcγRIIIB ile benzerlikgösteren olası kimerik bir bölge (ekzon 1 ile ekzon 2 ile ekzon 1 arasındaki intron bölgesi) tespitedildi.Sonuç olarak bu tez çalışmasında FNKD düşünülen hastalar ileri fonksiyonel ve genetikanalizler ile değerlendirildi. Hastalarda NK sayı ve fonksiyonları yönünden farklılıklar tespit edildi.FcγRIIIA geni ile ilgili tespit edilen polimorfizmler Türkiye popülasyonunda yapılmış ilkdeğerlendirme niteliğinde olup, NK hücre araştırmaları alanında yapılacak yeni çalışmalara ışıktutması beklenmektedir.

Natural killer cells (NK) are cells that play an important role in defending the organismagainst infections and cancer. NK cells have two important functions in the organism. The first is thedirect cytotoxic effect against microorganisms that cause infection, Secondly, it is an antibodydependentcellular cytotoxicity (ADCC) that is mediated by the FcγRIIIA gene product. Consideringthe important role of NK cells, disorder(s) in the NK cell number or function cause disease. Thisdisease originating from NK cells is called NK cell deficiency / disorder (NKD). From this point, NKcell subgroups, NK cell cytotoxicity and FcγRIIIA gene mutation(s) were investigated. The aim of thisstudy was to evaluate the relationship between clinical, laboratory and functional analysis andFcγRIIIA gene mutation(s).The study group consisted of 10 patients who were admitted to Necmettin ErbakanUniversity Meram Medical Faculty Pediatric Allergy and Immunology Policlinic for the first time andpreviously monitored and consisting of 7 healthy individuals were included in the control group. Allpatients and controls were evaluated for the determination of peripheral blood lymphocyte ratios andNK cell subgroups and cytotoxicity tests were performed to evaluate the functions of NK cells.FcγRIIIA gene mutations were investigated by next generation sequencing method.Three different NK cell subgroups, CD56brightCD16neg, CD56brightCD16int and CD56dimCD16hiwere identified in the NK cell subgroup analysis evaluated by peripheral blood flow cytometry. Nostatistically significant difference was found in the ratio of CD56brightCD16neg cells when NK cellsubsets of the patients were compared with the control group. CD56brightCD16int and CD56dimCD16hicell ratios were found to be significantly lower in patients compared to the control group. NK cellcytotoxicity was evaluated by K562 lysis dependent method. As a result of NK cell cytotoxicityanalysis, proportional decrease of K562 amount between patient and controls was found to bestatistically significant (p<0,001). It was found that the rate of K562 cell reduction in the patientsdecreased statistically less than the controls. Polymorphisms were detected in exon 4 (rs396991) andexon 3 (rs10127939) in the whole exom analysis of FcγRIIIA gene by new generation sequencingmethod. In addition, a possible chimeric region (exon 1 and exon 2 and exon 1 intron region) similarto FcγRIIIA and FcγRIIIB was determined by sequencing.In conclusion, in this study, patients with FNKD were evaluated with advanced functionaland genetic analyzes. Differences were found in terms of NK number and functions. FcγRIIIA genepolymorphisms were identified related to the population of Turkey is made in the first evaluation willbe done in the field of NK cell research is expected to shed light on the new study.