Agregasyon öncesi ve sonrası trombosit proteinlerinin 2 boyutlu polikrilamid jel elektroforezi (2DPAGE) ile incelenmesi

Abstract

1.ÖZET Bu çalışmada agregasyon öncesi ve trombin indüklü agregasyon sonrası trombosit proteinlerinin dağılım dinamiğinin incelenmesinde iki yönlü poliakrilamid jel elektroforezi (2D PAGE) tekniği başarıyla uygulandı. Proteinlerin yıkım ürünleri, sekresyon ve ekspresyon nedeniyle trombositlerde değişen eksilen, ortaya çıkan protein spotları ve spotların yoğunluk değişimleri karşılaştırmalı olarak incelendi. Normal olgulardan tromboferezle elde edilen trombositler sonikasyonla parçalanıp NP 40 deterjanı içeren doku homojenizasyon tamponunda protein solublizasyonu sağlandı. Proteinlerin ayrılmasında izoetektrik odaklama basamağında geniş pH gradienti (pH 2-pH 10) kullanıldı. İkinci basamakta ise %15 lik akrilamid konsantrasyonunda SDS (Sodyum dodesiisülfat) PAGE uygulandı. Böylece proteinleri geniş skalada ayırma imkanı sağlandı. Her bir jele 50 ^g protein tatbik edildi. Protein spotlannın görüntülenmesinde Coomassie brilliant blue R-250 (CBB-R250) kullanıldı. Agregasyon öncesi ve trombin indüklü (1IU/mL) agregasyon sonrası her bir jelde 75 ile 80 arası protein spotu saptandı. Agregasyon sonrasında molekül ağırlıkları 97-66 kDa arasında değişen ve ve izoetektrik noktaları (pl)ı 8-10 arasında bulunan bazı proteinlerin trombositlerde miktarlarının artığı gözlendi. Yine agregasyon sonrası molekül ağırlıkları 205 kDa'un üzeinde ve pl'Ian 6-8 aralığında yeni sentezlenmiş trombosit proteinleri tespit edildi. Molekül ağırlığı 20,1 kDa'dan düşük trombosit proteinlerin agregasyon sonrası arttığı görüldü.

2.SUMMARY Observation of Platelet Proteins, After Aggregation and Before Agregation, Using Two Dimensional Polyacrylamide Gel Electrophoresis (2D PAGE). In this work we have analyzed changes and alterations involved in the dynamics of protein distribution before and after thrombin induced platelet aggregation with two dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (2D PAGE). 2 D PAGE protein separation method offers a huge potential for the provision of comprehensive protein expression data for basal and activated platelets This technology has the potential to identify isoforms of proteins or identification of the platelet based diseases. There are many investigations using this technique such as studies on membrane protein expression, associated proteins with cytoskeleton following cell activation, the frequency of polymorphisms in platelet proteins. The proteins were separated by using 2 D PAGE. As the first step, protein isoelectric focusing was done in a broad range of pH gradiends (pH2-pH10) and as the second step SDS PAGE was performed at 15 % acrylamide concentration. This way it was possible to separate proteins in a wide range of isoelectric points (pis) and molecular weights. 50 ug protein was applied to each gel and coomassie brilliant blue (CBBR -250) was used for detection of protein spots. In each gel 75 to 80 protein spots were detected. After thrombin (1 lU/mL) induced aggregation, increased expression of some proteins having molecular weights between 66 to 95 kDa and pis between 8-10 were detected. Also newly syntesized proteins over 205 kDa and pis between 6 to 8 and increase in number of protein spots under 20,1 kDa and pis between 2 to 1 0 were observed. In this study, the 2D PAGE was established successfully. It was possible to detect comperatively protein spot variations in isolated platelets like disapparence and appearence of new protein spots and changes in intensity of spots caused by protein degregation, secretion and/or expression.