Tumor necrosis factor-related apoptosis-ınducing ligand (TRAİL) ve epoksomisin`in osteosarkom hücrelerinde apoptozis üzerine etkileri

Abstract

Osteosarkom hastalarında, kemoterapinin dezavantajlarından ve bazı hastalarda gelişen dirençten dolayı, yeni ve daha güvenli bir tedaviye ihtiyaç duyulmaktadır. Tümör tedavilerinde yeni bir dönem açacağı düşünülen TRAIL birçok tümörde denenmektedir. Osteosarkom hücrelerinin TRAIL'a karşı dirençli olduğu bilinmektedir. Bazı kanser hücrelerinde proteazom inhibitörlerinin TRAIL hassasiyetini arttırdığını bildiren yayınlar vardır. Ancak TRAIL'e dirençli osteosarkom hücrelerinde proteazom inhibitörlerinden epoxomicinin (epoksomisin) bu direnci nasıl etkilediği daha önce çalışılmamıştır. Ayrıca yaptığımız literatür taramasında epoxomicinin osteosarkom hücreleri üzerine etkisini araştıran bir çalışmaya rastlamadık. Bu nedenlerden dolayı epoxomicinin osteosarkom hücrelerinde apoptozis ve hücre sitotoksisitesi üzerindeki etkilerini ve epoxomicinin TRAIL'a dirençli MG-63 ve Saos-2 hücre dizilerinde TRAIL hassasiyetini arttırıp arttırmadığını araştırdık.Epoxomicin ve/veya TRAIL ile inkübe edilen hücrelerde hücre canlılıkları kolorimetrik yöntem prensibiyle ölçüm yapan MTT ve WST-8 kitleri ile tespit edildi. Kaspaz-3, -8 ve -9 aktiviteleri ve pro-apoptotik Bax protein düzeyleri spektrofotometrik kitler ile ölçüldü. Apoptozis oluşumu immunokimyasal olarak TUNEL metodu ile değerlendirildi.MG-63 ve Saos-2 hücre canlılıkları üzerindeki TRAIL ve/veya epoxomicin etkisini, doza ve zamana (24, 48, 72 saat) bağımlı olarak değerlendirdik. MG-63 hücrelerinde epoxomicin LD50 dozlarını, 24 saatlik inkübasyon sonrası 272 nM,48 saatlik inkübasyon sonrası 124 nM ve 72 saatlik inkübasyon sonrası 12 olarak bulduk. Saos-2 hücrelerinde ise epoxomicin LD50 dozlarını, 24 saatlik inkübasyon sonrası 355 nM, 48 saatlik inkübasyon sonrası 255 nM ve 72 saatlik inkübasyon sonrası 7 nM olarak bulduk. TRAIL ve epoxomicinin kombine olarak uygulandığı grupta kaspaz-3,-8,-9 aktiviteleri ve Bax proteini düzeyleri, sadece TRAIL veya epoxomicin uygulanan gruplar ile karşılaştırıldığında, anlamlı düzeyde artmış olarak bulundu (p<0.01). Bulgularımız, TRAIL ve epoxomicin kombinasyonlarının düşük dozlarının bile sinerjistik etki göstererek, osteosarkom hücrelerindeki TRAIL dirençliliğinin azalmasında etkili olduğunu ortaya koydu.Çalışmamızda, epoxomicinin osteosarkom hücreleri üzerine sitotoksik etkili olduğunu tespit ettik. Bulgularımız, osteosarkom hücrelerinde TRAIL direncinin epoxomicin ile kırılabileceğini gösteren ilk araştırma olması açısından da önemlidir. Yaptığımız araştırmanın, TRAIL ile geliştirilebilecek tedavi yaklaşımlarına katkı sağlayacağını kanısındayız

Osteosarcoma (OS) is one of the most frequent primary malignant tumors of bone. Despite recent improvement in therapy, there is inherent or acquired resistance to chemotherapeutic agents in some OS cases. In addition, the other disadvantages of the chemotherapeutic agentsare their cyctotoxic effects to normal tissues and organs. Novel therapeutic approaches are needed for improvement of OS treatment. The purpose of our study was to determine the effects of epoxomicin on TRAIL resistance in MG-63 and Saos-2 osteosarcoma cells with an attempt to find novel anti-cancer agents that target cancer cells or confer synergy with TRAIL.We determined the cytotoxic effect of epoxomicin and TRAIL in Saos-2 and MG-63 OS cell lines using MTT and WST-8 assays. We measured apoptosis markers such as caspase -3, -8, -9 activities and pro-apoptotic Bax levels. We demonstrated apoptosis immunochemically using TUNEL assay. We foundLD50 doses of epoxomicin on MG-63 cells viability as 272 nM, 124 nM and 12 nM after incubations for 24, 48, and 72 h, respectively (P<0.001). We found LD50 doses of epoxomicin on Saos-2 cells viability as approximately 355 nM, 255 nM and 7 nM after incubations for 24, 48, and 72 h, respectively. Incubation with TRAIL and epoxomicin for 24 h significantly increased caspase -3, -8, -9 activities and Bax levels compared to the cells incubated separately with TRAIL or epoxomicin (p<0.01). We determined cell viabilities of MG-63 and Saos-2 upon incubation with different doses of TRAIL and Epoxomicin. This dose study gives us useful information for further apoptosis studies.Our data demonstrated that combining TRAIL with epoxomicin enhanced apoptosis and overcome TRAIL resistance which promises improvement in future OS treatment modalitiesKey words: Osteosarcoma, TRAIL, Epoxomicin, Apoptosis, MG-63, Saos-2.