Effect of membrane fluidity on binding of 125I-Insulin to sheep liver membrane receptors

Abstract

ÖZET -125I-INSULİN'İN Koyun Karaciğeri Hücre Zarı Reseptörlerine BA?LANMASINDA HÜCRE ZARI AKIŞKANLI?ININ ETKİSİ Hüseyin Avni ÖKTEM Yüksek Lisans Tezi, Biyokimya Tez Yöneticisi: Y. Doç. Dr. Meral Yücel Temmuz 1987, 75 sahife Koyun karaciğeri hücre zarları 0.25 M sukroz çözeltisinde ha zırlanmış olan homogenatl ardan diferensiyel santrifüjleme yoluyla safi aştın İdi. Saflaştırılmış hücre zarının protein ve lipid derişimleri sıra ile 5.60 ve 10.68 mg/ml olarak tayin edildi. Zar protein lerinin karakterizasyonu sodyum dodesil sulfat-poliakrilamid jel elektroforezinde yapıldı ve reseptörlerin daha ileri safhada saflaştırılmasına geçilmedi. 125 I-insulinin hücre zarındaki reseptörlere bağlanma aktivite- 125 si selüloz-asetat filtreleri kullanılarak polietilen glikol ile I- insulin-reseptör bileşeninin çöktürülmesi yöntemi ile tayin edildi. özgün bağlanma protein derişimindeki artışla doğru orantılıydı. 125 I-ınsulin bağlanması farklı etkenlerle oluşturulan hücre zarı akışkanlığına bağımlılık gösterdi. 0°C'de yapılan çalışmalarda -v-bağlanma aktivitesi düşük düzeyde olduğu halde 24°C'de artış kayde dildi. 37°C başlangıçta bağlanmada ani bir artış olmasına rağmen 50 dakika inkübasyondan sonra bir düşüş gözlendi. İki değerlikli katyonlar 4.76 mM derişimde birbirine benzer davranış gösterdi, bağlanmayı önce arttırıp sonradan düşürdü. 9.09 mM Mg derişiminde devamlı bir artış vardı. Hücre zarlarının yüksek derişimdeki lipazla (229 unit/mg zar proteini) muamelesinde 125 I-insulin bağlanması azaldı, diğer taraftan 125 126 unit/mg derişimde 125 I-insulin bağlanmasında başlangıçta sonradan düşüş gösteren bir artış vardı. Hücre zarının kolesterolle muamelesi sonucunda akışkanlığının azalması (viskos hal) 125 I-insulin bağlanmasını arttırdı. Bununla bir likte zarın yumurta akı lesitiniyle muamelesinde bağlanma aktivitesin- de kayda değer bir artış gözlenmedi. Sonuçlar koyun karaciğeri insulin reseptörlerinin hormona bağlanma özelliklerindeki değişimlerinin hücre zarı lipid akışkanlığı ve yapısı gibi hem fiziksel hem de kimyasal Özelliklerine bağlı olduğu şeklinde yorumlandı. Anahtar sözcükler: İnsulin reseptörleri, hücre zarı akışkanlığı, 125 I-insulin bağlanması, hormon-reseptör ilişkisi, koyun karaciğeri, insulin reseptörleri, -vi-

ABSTRACT Effect of Membrane Fluidity on Binding of -^I-insulin to Sheep Liver Membrane Receptors Hüseyin avnî 'öktem M.S. in Biochemistry Supervisor: Asst.Prof.Dr. Meral Yücel July 1987, 75 pages Sheep liver membrane was purified by differential centrifuga- tion of homogenates prepared in 0.25 M sucrose. The final protein and lipid concentrations of the purified membrane were 5,60 mg/ml and 10.68 mg/ml respectively. The characterization of the membrane proteins was carried ou% by odium dodecyl sulfate polyacryl amide gel electro phoresis and no further solubilization of receptor was achieved. 125 I-insulin binding activity of the receptors in the intact membrane was determined by polyethylene glycol precipitation on cellulose acetate millipore filters. The specific binding was linear over at least five fold range of protein concentration. 125 The binding of I-insulin showed variations due to the lipid fluidity of the membrane produced by different effectors. ?m-Binding was minimum at 0 C and increased at 24 C. At 37 C initially there was a rapid increase, followed by a decrease after 50 minutes of incubation. Divalent cations Ca and Mg at 4.76 mM showed same type 125 of behaviour, first increased then decreased the binding of I- insulin. At 9.06 mM Mg concentration there was a considerable increase in the binding activity. Treatment of the membrane with higher concentration of Lipase 1 ?R (229 units/mg membrane protein) decreased the binding of I-insulin whereas at 126 units/mg concentration, initially there was a rapid increase in binding then followed by a decrease. As the membrane lipids became more viscous in the presence of cholesterol binding increased. However upon treatment with egg yolk lecithin (fluidity increase) no considerable change in the binding activity was observed. These results strongly suggested a variation in binding properties of sheep liver insulin receptors due to alterations in both physical and chemical properties of the membrane lipids such as fluidity and composition respectively. 125 Key words: Insulin receptors, membrane, fluidity, I-insulin binding, hormone- receptor interactions, sheep liver. -IV-