Purification of bacteriorhodopsin from halobacterium halobium and reconstitution studies in liposomes

Abstract

Bacteriorhodopsin, 37 C yüksek derişimi. NaCİ ihtiva eden ortamda büyütülmüş olan Halobacterium halobium S-9 türünden saf laştırıldı. Saflaştırma işlemleri sonucunda protein derişimi 1.8 mg/ml olarak bulundu. Molekül ağırlığı, sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezinde 26.500 daltona tekabül eden tek bir protein bandı olarak tesbit edildi. Saf laştırılmış olan BR'ın absorbsiyon spektrumu 560 nm ve 280 nm de iki maksima verdi. Saflaştırıldıktan sonra - 20 de saklanan BR'nin 560 nm deki absorbs iyonunda zamanla azalma gözlendi. BR'ın asidik ortamdaki absorpsi- yon spekrumunda 603 nm de yeni bir bileşen görüldü. Saflaştırılmış BR yumurta akı lesitini ile hazırlan mış olan lipozomlara tutturuldu. Lipozoma tutturulmuş olan BR'ın ışıkla uyarıldığında proton pompalama aktivitesi(photo elektrik aktivite) pH elektrodu ile pH değişimi olarak ölçüldü. Photo elektrik aktivitesinin ışık inten- sitesi ile etkilendiği görüldü. Düşük intensitedeki (1000 W) ışık ile yapılan aydınlatma sonucunda elde edilen neticede, Lipozoma tutturulmuş BR'm normal bak teride olduğu gibi protonu dışarı doğru pompaladığı gözlendi. Yüksek intensitedeki (2000 W) aydınlatmalarda, tutturulmuş BR'ın her iki doğrultuda da proton pompalaması ve aktivitesindeki artış, tutturulmuş BR da ışığa bağımlı konformasyon değişikliğinden kaynaklandığı şeklinde yorumlandı. Proton pompalama aktivitesinin ortamın PH sına ve BR'm lipozoma tutturulma pH sına bağlılık gösterdiği gözlendi.

Bacteriorhodopsin was purified from Halobacterium halobium S-9 strain which was grown in approximately saturated NaCl medium at 37 C. The protein concentration of the purified BR was 1.8 mg/ml. The protein gave a single band upon sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, corresponding to Mr of 26.500 dalton. The absorption spectrum of BR showed maxima at 55 0 nm and 280 nm. The absorption properties was found to change upon storage at -20 C that the intensity of the maxima at 560 nm decreased. The absorption spectrum of BR in acidic medium gave a new complex at 603 nm. The purified BR was incorporeted into egg yolk lecithin liposomes and the photoenergetic activity of BR in the reconstituted system was measured with a combined pH electrode. The photoelectrical response of BR was significantly affected by the intensity of the light exposed. Upon illumination by 1000 Watt light source the proton pumping direction of reconstituted BR was the same with the natural bacterial membrane, towards outside. The proton pumping characteristic of the system was changed at high light intersity (2000 W light source). The protons were first released and then picked up during the illumination and the rate of proton pumping activity of reconstituted BR increased. That might be the result of the light induced conformational change of BR molecules in the liposomes. The amount of proton released was also affected by reconstitution pH and pH of the medium.