Oksiadatif stresle aktive edilen TRPM2 katyon kanallarının inaktivasyonunda melatoninin etkisinin Patch-clamp sistemi ile araştırılması

Abstract

Transient Reseptör Potansiyel Melastatin Kanalları 2 (TRPM2) hücredeki oksidatif stresin indikatörlerinden biri olan H2O2 tarafından aktive edilebilen, seçici olmayan ve Ca2+'a geçirgen katyon kanalıdır. Yapılan son çalışmalarda TRPM2 kanallarının aminoethoxydiphenyl borate (2-APB) tarafından hızlı ve geri dönüşümlü bir şekilde kapatılabileceği gösterilmiştir. Melatonin pineal bezden salgılanan ve çok yüksek miktarda antioksidan özelliğe sahip bir nörohormondur. Bu çalışmamızda melatoninin transfekte CHO hücrelerinde tüm hücre akımları ve H2O2 ile aktive edilmiş TRPM2 kanalı Ca+2 akımları üzerine olan etkileri araştırılmıştır.Yama-menteşe tekniğinin tüm hücre konfigürasyonu kullanılarak H2O2 ile indüklenmiş TRPM2 kanal kayıtları elde edilmiştir. Kanal akımlarının, hem ekstraselüler (300 µM ve 1 mM) hem de intraselüler (200 µM) olarak uygulanan melatonin tarafından inhibe edildiği gözlemlenmiştir. Sitozole Ca+2 akışı Fura-2 kullanılarak ölçüldü. Kontrol gruplarında sitozolik serbest Ca+2 miktarının H2O2 grubuna göre daha düşük düzeyde olduğu tespit edildi. İntraselüler melatonin (200 µM) uygulaması ile H2O2'nin sebep olduğu TRPM2 kanal akımlarının engellendiği tespit edilirken kanalların bloke edilmesinde 2-APB nin etkisiz olduğu tespit edildi. Ayrıca melatoninin apoptozisi de doza bağımlı olarak inhibe ettiği gözlemlendi.Sonuç olarak; intraselüler melatoninin transfekte CHO hücrelerinde TRPM2 kanal kalsiyum akımları ve apoptozis üzerine düzenleyici etkisinin olduğu gözlemlendi. Bizim bulgularımız; melatoninin azlığı sebebiyle sitozole Ca+2 girişinin arttığını ve bunun oksidatif strese bağlı hastalıkların ortak bir özelliği olabileceğini göstermiştir.

Transient Receptor Potential Melastatin-Like 2 (TRPM2) is a non-selective Ca2+ permeable cation channel and is known to be activated by H2O2 which is one of the most important indicators of intracellular oxidative stress. Recent reports exhibited that TRPM2 currents may be blocked by aminoethoxydiphenyl borate (2-APB) in a manner rapid and reversible. Melatonin is a neurohormone and has a very high antioxidant effect, which released from pineal gland. In this study we investigated effects of melatonin on whole cell currents and Ca2+ influx arising from TRPM2 channels activated by H2O2 in transfected Chinese Hamster Ovary Cells (CHO).In whole-cell patch clamp experiments, TRPM2 currents in the cells were consistently induced by H2O2. However, the current were inhibited by both extracellular (0.3 mM and 1 mM for 2 hours incubation) and intracellular (0.2 mM) melatonin. Cytosolic Ca2+ release was measured by Fura- 2 and the cytosolic free Ca2+ content of the cells were higher in H2O2 groups than in control. When intracellular melatonin is introduced by pipette TRPM2 channel currents were not activated by H2O2 although H2O2-induced Ca2+ gates and release were not blocked by the 2-APB. Melatonin inhibited also apoptosis dose dependent.In conclusion, we observed the modulator role of intracellular melatonin on Ca2+ influx and apoptosis through a TRPM2 channel in transfected CHO cells. Since cytosolic melatonin depletion due to Ca2+ influx is a common feature of oxidative stress-induced diseases, our findings are relevant to the etiology of pathology in oxidative stress-induced diseases.