Yağda çözünen vitaminlerin yüksek performanslı sıvı kromatografisi-kütle spektrometrisi metodu ile eş zamanlı tayin metodunun geliştirilmesi ve optimizasyonu

Abstract

Amaç: Yağda çözünen vitaminler (A, D, E ve K) izopren türevi apolar moleküllerdir. Enzim aktivitesinde koenzim olarak (biyokatalizör) görev alırlar. Metabolizmayı düzenlerler, karbonhidrat, yağ ve proteinlerin enerjiye dönüşümüne yardım ederler. Vücut yapılarına katılmazlar. Yerleri başka maddelerle doldurulamaz. Eksik ya da yüksek seviyelerine bağlı bazı hastalıklar ve semptomlar gözlemlenebilir. Bu nedenle, yağda çözünen vitamin seviyelerinin ölçümleri önemlidir. Bu tez çalışmasında, yağda çözünen vitaminlerin eş zamanlı analizine imkân sağlayan, hassas ve seçici bir LC-MS/MS metodunun geliştirilmesi ve valide edilmesi amaçlanmıştır.Gereç ve Yöntem: Serum örnekleri metanol ile deproteinize edildi ve analitlerin kromatografik ayırımı LC-MS/MS sistemi (Agilent Technologies 6420 TripleQuadrapole LC-MS), Agilent Pursuit PFP kolon (100mm×3,0mm; 3,0 μm), gradient modunda Mobil faz A (H20+%0,1 formik asit) ve Mobil faz B (Metanol+%0,1 formik asit) kullanılarak gerçekleştirildi. İyon taraması MRM (multiple reaksiyon izleme) modunda, ESI iyon kaynağında pozitif iyon seçiciliği ile yapıldı. Bulgular: Vitaminlerin alıkonma süreleri vitamin 25-OHD3 için 7,52 dakika, vitamin A için 7,56 dakika ve vitamin E için 9,65 dakikadır. Metot vitamin A, vitamin E ve 25-OHD3 için sırasıyla 3,0-90,0 μg/dL, 3,0-90,0 μg/mL ve 5,0-150,0 ng/mL arasında lineerdir. Gün içi CV% değerleri vitamin A, vitamin E ve 25-OHD3 için sırasıyla %9,38, %10,23 ve %3,27; günler arası CV% değerleri sırasıyla %3,69, %6,19 ve %4,11'dir. Tespit sınırı ve tayin sınırına S/N oranı ile karar verildi. LOD ve LOQ sırasıyla S/N≥3 ve S/N≥10'dur.Sonuç: Bu çalışmada, yağda çözünen vitaminlerin seviyelerini 13 dakikada analiz edebilecek bir LC-MS/MS metodu geliştirilmiş ve valide edilmiştir. Bu metot, düşük hassasiyete sahip immünoassay yöntemleri ve eş zamanlı analize olanak sağlayamayan HPLC yöntemlerine göre çok daha kısa sürede ve birlikte tespitine imkân sağlayabilecek güvenilir bir yöntem olarak değerlendirilmiştir.Anahtar Kelimeler: LC-MS/MS, Metot Geliştirme, Validasyon, Yağda Çözünen Vitaminler

Objective: Fat-soluble vitamins (A, D, E and K) are isoprene derived apolar molecules. They act as coenzyme (biocatalyst) in enzyme activity. They regulate metabolism and help convert carbohydrates, fats and proteins into energy. They don't participate in body structures. Places cannot be filled with other substances. Some diseases and symptoms may be observed due to incomplete or elevated levels. Therefore, in this thesis study, it is aimed to develop and validate a sensitive and specific LC-MS/MS method that allows simultaneous analysis of fat-soluble vitamins.Materials and Methods: Serum samples were deproteinized with methanol and chromatographic separation of analytes were performed by LC-MS/MS system (AgilentTechnologies 6420 Triple Quadrapole LC-MS), Agilent Pursuit PFP column (100mm×3,0mm; 3,0 μm), in gradient mode using Mobile phase A (H2O+0,1% formic acid) and Mobile phase B (Methanol+0,1% formic acid). Ion scan was performed in MRM (multiple reaction monitoring) mode with positive ion selectivity in ESI ion source. Results: The retention times of the vitamins are 25-OHD3 7,52 min, Vitamin A 7,56 min and Vitamin E 9,65 min. The method is lineer between 3,0-90,0 μg /dL, 3,0-90,0 μg/mLand 5,0-150,0 ng/ml for Vitamin A, Vitamin E and 25-OHD3; respectively. Intra-day CV% values for Vitamin A, Vitamin E and 25-OHD3 are; 9,38%, 10,23% and 3,27% and inter-day CV% values are; 3,79%, 4,19% and 4,11%. The limit of determination and the limit of quantitaion were determined by the S/N ratio. The LOD and LOQ are S/N≥3 and S/N≥10 respectively.Conclusion: In this study, a LC-MS/MS method that can analyze fat soluble vitamins in 13 minutes was developed and validated. This method will be useful for clinical purposes by replacing low sensitivity immunoassay methods and HPLC methods that can not allow simultaneous analysis. Keywords: LC-MS/MS, Method Development, Validation, Fat-SolubleVitamins