Deneysel olarak diyabet oluşturulmuş sıçanlarda yara modeli üzerine periferik mononükleer kök hücre ve bunlardan farklandırılmış langerhans hücre uygulamasının iyileşme üzerine etkileri

Abstract

Deride yara iyileşmesi özellikle kronik ve diyabetik olanlarda maliyetli ve hasta yaşam kalitesini azaltan zor durumlardır. Bu konuda son zamanlarda kök hücre tedavisi giderek artan önem kazanmış ve değişik kaynaklardan elde edilen hücresel ürünler klinik kullanımda tedavide yerini almıştır. Periferik Mononükleer Kök Hücre (PKMH) periferik dolaşımdan kolaylıkla elde edilen ve uygulanabilecek bir KH türüdür. PKMH ile yara iyileşmesinde çok az yayın olup bunlardan farklanan langerhans hücreleri (FLH) ile tedavideki etki bilinmemektedir. Bu çalışmada, PKMH ve FLH deneysel diyabetik greft yara modelinde iyileşmeye etki açısından incelendi ve karşılaştırılarak olası mekanizmalar için değerlendirildi. Alınan kan örneklerinde PKMH izolasyonu, kültürde çoğaltılması ve FLH farklılaştırılması sağlandı. Erişkin Wistar albino sıçanların sırt bölgesi traşlanarak 1x1 cm boyutunda karşılıklı yer değiştirmek suretiyle dört adet tam kat deri grefti yapıldı. Kültür ortamında greftlar üzerine kök hücreler ekilerek yara bölgesine uygulandı. Sıçanlar diyabetli olanlar (DG) beş ve olmayanlar (NDG) beş grup olarak 10 gruba ayrıldı. Kontrol grubuna sadece greft yara modeli yapılacak, sham grubuna sadece besiyeri uygulanacak ve diğer gruplara ise, besiyeri içerisinde PMHK, FLH ve birlikte olacak şekilde greft üzerinde yara bölgesine uygulandı. Hücresel tedavi 7 gün boyunca her bir yaraya 1x106 hücre uygulandı. Sırttaki greftlerden 3. ve 7. günlerde biyopsi ile örnekler incelendi. Histokimyasal (HK) olarak H-E, masson trichrome (MT) ve PAS, immunohistokimyasal (İHK) olarak oksidatif stres için e-NOS ve i-NOS, çoğalma belirteci olarak PCNA, damarlanma belirteci olarak VEGF, inflamasyon belirteci olarak IL-1 ile apoptoz için TUNEL boyaması yapıldı. Mikroskop altında alınan görüntüler dijital ortama aktarılıp imageJ ile morfometrik ve H-skor ile değerlendirilip gruplar arasında farkın istatistiği bulundu. Kültür ortamında deri üzerine ekilen hücrelerin SEM analizi yapıldı.PKMH ve FLH izolasyonu kolay olmasına rağmen çoğalmadıkları gözlendi. Yapılan karakterizasyonlarında KH belirteçlerini pozitif ve negative olarak exprese ettikleri izlendi. Hücrelerin SEM analizinde deri üzerinde kaldıkları ve deri ile etkileşimde oldukları saptandı. Yapılan greft uygulamalarından iyileşmenin hızlı gerçekleştiği ve NDG için 2 ile 4 gün ve DG için ise 4 ve 7 günler arasında yaranın kapandığı izlendi. 3. günde arasında ve HK olarak H-E, masson trichrome (MT) ve PAS boyamalarında DG için daha da belirginleşen ve etkinleşen histopatolojik düzelmeler görüldü. Morfometrik analizde epitel kalınlığı (EK), Fibroblast sayısı (FS), yeni damar oluşumu (YDO), kollajen (KOL), matriks ve fibril dağılımın anlamlı olarak iyileştiği bulundu. İHK olarak yine DG için belirgin ve etkin belirteç değşiklikleri saptandı. Oksidatif stres için e-NOS ve i-NOS, çoğalma belirteci olarak PCNA anlamlı olarak artmadığı, damarlanma belirteci olarak VEGF artışı, inflamasyon belirteci olarak IL-1 azalışları ile apoptoz için TUNEL boyamasında anlamlı azalma izlendi. Mikroskop altında alınan görüntüler dijital ortama aktarılıp imageJ ile morfometrik ve H-skor ile değerlendirildiğinde görüntülerde izlenen değişikliklerin istatiksel olarak anlamlılığı ortaya kondu. KH uygulamasının tek uygulamalarındaki anlamlı katkı ve başarı birlikte uygulamalarında daha da belirginleşti. Daha dengeli, olgun ve komplikasyonsuz yara iyileşmesi oluştu. Kültür ortamında deri üzerine uygulanan bu yeni hücresel tedavinin başarılı ve etkin greftlemesi diyabetik zor yara iyileşmesinde greft etkinliğinin ve başarının arttırılmasını sağlayacağı bulundu. Ileri düzeyde mekanizmalarının araştırılmasının bilime katkı sağlayacağı ve faz çalışmalarında insan klinik uygulamasında maliyetleri azaltarak hasta yaşam kalitesini arttıracağı düşünüldü.Anahtar kelimeler; Diyabet, Greft, Yara Iyileşmesi, Periferik Mononükleer Kök Hücre, Langerhans hücre faklılaşması

Chronic injuries that are difficult to heal, such as diabetes, are a problem in medical treatment. Seeking new treatment protocols is an important issue that has begun to be used in stem cell clinics. Peripheral Blood Mononuclear Cell (PBMC) is a good source of stem cells that can easily be obtained from peripheral circulation and can be easily applied to patients under good production conditions. Our study aimed to compare PBMC and Langerhans cells alone and in combination to determine whether these two stimuli were stimulating each other and to apply them to skin grafts in an experimental animal model to demonstrate their benefit in the treatment of chronic wounds. Diabetes Mellitus is now becoming an increasingly international health problem. Diabetic complications include numerous accompanying problems, including severe wound healing, chronic ulceration, and severe complications of the resulting limb amputation. Cellular products have begun to be used in an increasingly broad spectrum of disease treatments in recent years. Among these cellular products, PBMC is used in the treatment of various diseases, especially hematological malignancies. It is also known that langerhans cells, which play an active role in wound healing, especially in the inflammatory phase, have important immunological functions. In addition, in vivo experiments have shown that Langerhans cells play an important role in epidermal homeostasis and wound healing is particularly beneficial in early stages. The specificity of this study is to investigate the effects of the langerhans cells differentiated from the root cell in difficult-to-heal wounds and the mechanisms of their action in the treatment unknown in the literature. In this study, PBMC isolation, culture propagation and differentiation of langerhans cells (dLC) will be provided. These cells will be applied on the grafts in the culture medium and applied to the wound area. The back region of Wistar albino rats will be cut and four (four) full fold skin grafts of 1 x 1 cm size will be reciprocally replaced. Then the rats will be divided into 10 groups; only the graft wound model will be applied to the control group, only the feeder will be applied to the sham group and the other groups will be applied to the wound area on the PBMC and dLC grafts in the feeder. Cellular therapy will be repeated intradermally in a single dose for 14 days. On the 3rd and 7th days from the grafts on the back, samples will be taken with biopsy. In cellular therapy, 1x106 cells will be administered to the side of each wound of PBMC and dLC. During the wound healing process, cell application will be repeated to the biopsied areas. Also histochemically, hematoxylin-eosin, PAS and masson trichrome staining,; immunohistochemically, e-NOS, i-NOS for oxidative stress, PCNA as proliferative marker,VEGF marker for vascularization, IL-1 as inflammation markers and TUNEL staining for apoptosis will be performed. The images taken under the microscope will be transferred to the digital platform and evaluated by morphometric and H-score. The difference between the groups will be statistically analyzed. Success will be achieved when our study shows that PBMC and dLC contributes to supportive care in the treatment of chronic wounds such as diabetic foot. This success is thought to be an application that reduces costs and increases patient quality of life. It is expected that it will contribute to the literature by publishing the quality journal and be an effective product in clinical use.