Optimization of selection conditions and agrobacterium mediated transformation of chickpea (Cicer arietinum L. cv. Gökçe)

Abstract

ÖZ NOHUTTA (Cicer arietinum L. ev. Gökçe) SEÇME KOŞULLARI VE AGROBAKTERİYE DAYALI TRANSFORMASYONUN OPTİMİZASYONU Öz, M. Tufan Yüksek Lisans, Biyoteknoloji Bölümü Tez yöneticisi: Prof. Dr. Hüseyin Avni Öktem Ortak tez yöneticisi: Y. Doç. Dr. Füsun Eyidoğan Ocak 2005, 148 sayfa Bu çalışmanın amacı, nohutta {Cicer arietinum L.) verimli bir seçme sistemi ve Agrobakteriye dayalı transformasyonun optimize edilmesiydi. Türk nohut çeşidi Gökçe 'ye ait kotiledon boğumlan, seçici ajanların; iki antibiyotik (Kanamisin, Higromisin) ve iki herbisit (PPT, Glifosat) ile Agrobakteri eliminasyonunda kullanılan dört antibiyotiğin (Augmentin, Karbenisilin, Sefotaksim, Timentin) çoklu sürgün ve kök oluşumu üstüne etkilerinin araştırılmasında kullanılmıştır. Seçici ajanlar ve antibiyotikler eksplantlara farklı konsantrasyonlarda bir ay süre ile uygulanmış ve rej enere edilen sürgün ve kök sayısı kaydedilmiştir. 100 mg/L Kanamisin, 20 mg/L vıHigromisin, 3 mg/L PPT ve 5 mg/L Glifosat nohut transformantlannın seçiminde kullanılmaya uygun bulunmuşlardır. Tüm seçici ajanlar kullanılan en düşük konsantrasyonlarında (50 mg/L Kanamisin, 10 mg/L Higromisin, 3 mg/L PPT, 1 mg/L Glifosat) rejenere edilmiş gövdelerin köklenmesini tamamen durdurmuştur. Agrobakteri-eliminasyon antibiyotikleri arasında Sefotaksim ve Augmentin sürgün oluşumu üstüne herhangi kötü bir etki göstermemiş; bunun yam sıra dört haftalık kültür sonunda Timentin (300 mg/L) gövde oluşumunu arttırmış, Karbenisillin (300 mg/L) ise düşürmüştür. Augmentin'in nohut sürgünlerinin köklenme kapasitesi üstüne herhangi bir etkisinin olmadığı bulunmuştur. Ancak Sefotaksim kullanılan tüm konsantrasyonlarda kök oluşumunu anlamlı bir şekilde düşürmüştür. Diğer taraftan sadece yüksek konsantrasyonlarında Karbenisilin (300 mg/L) ve Timentin (200 mg/L) köklenmeyi anlamlı bir şekilde düşürmüştür. Sulbaktam'ın Karbenisilin ve Sefotaksim ile kombinasyonları bakteri büyümesi üstünde etkili engellemeler göstermiştir. Ayrıca Gökçe kotiledon boğumlan için Agrobakteriye dayalı transformasyon prosedürü, transformasyonu takip eden 4, 9 ve 16ncı günlerde uidA geni geçici ifadesi izlenerek optimize edilmiştir. Transformasyon prosedürü, eksplantlann aksiller bölgesinin mekanik olarak yaralanmasıyla ve vakum infiltrasyonun 200 mmHg basınçta 40 dakika uygulanmasıyla geliştirilmiştir. Anahtar kelimeler: Nohut kotiledon boğumu; Transgenik seçimi; Agrobacterium tumefaciens; GUS; Geçici gen ifadesi vıı

ABSTRACT OPTIMIZATION OF SELECTION CONDITIONS AND AGROBACTERIUM MEDIATED TRANSFORMATION OF CHICKPEA (Cicer arietinum L. ev. Gökçe) Öz, M. Tufan M. Sc, Department of Biotechnology Supervisor: Prof. Dr. Hüseyin Avni Öktem Co-supervisor: Assist. Prof. Dr. Füsun Eyidoğan January 2005, 148 pages The objective of this study was to optimize an efficient selection system and Agrobacterium mediated transformation of chickpea {Cicer arietinum L.). Cotyledonary node explants of Turkish chickpea cultivar Gökçe were used to determine the effects of selective agents, two antibiotics (Kanamycin, Hygromycin) and two herbicides (PPT, Glyphosate) as well as four antibiotics (Augmentin, Carbenicillin, Cefotaxime, Timentin) for eliminating Agrobacterium on multiple shoot and root induction. Selective agents and antibiotics were applied to explants at different concentrations for one month and numbers of regenerated shoots and roots were recorded. Kanamycin at 100 mg/L, Hygromycin at 20 IVmg/L, PPT at 3 mg/L and Glyphosate at 5 mg/L were found to be appropriate to select chickpea transformants. Lowest concentrations of all selective agents (50 mg/L Kanamycin, 10 mg/L Hygromycin, 3 mg/L PPT, 1 mg/L Glyphosate) totally inhibited rooting of the regenerated shoots. Among the Agrobacterium-elumnating antibiotics, Cefotaxime and Augmentin each up to 600 mg/L had no adverse effect on shoot induction, whereas Timentin (300 mg/L) significantly increased and Carbenicillin (300 mg/L) significantly decreased shoot induction after four weeks of culture. Augmentin was determined to have no effect on rooting capacities of chickpea shoots. However Cefotaxime at all concentrations significantly decreased root induction. On the other hand only high concentrations of Carbenicillin (300 mg/L) and Timentin (200 mg/L) significantly decreased rooting. Sulbactam in combination with Carbenicillin and Cefotaxime displayed effective inhibition of bacterial growth. Furthermore, Agrobacterium mediated transformation procedure for cotyledonary node explants of Gökçe, was also optimized by monitoring transient uidA expression on 4th, 9th, and 16th days after transformation. Transformation procedure was improved via mechanical injury of axillary region of explants and application of vacuum infiltration at 200 mmHg for 40 minutes. Keywords: Chickpea cotyledonary node; Transgenic selection; Agrobacterium tumefaciens; GUS; Transient gene expression.