Recombinant Pyrococcus furiosus extracellular alpha-amylase expression in Pichia pastoris

Abstract

Bu çalışmada P. furiosus hücre dışı alfa-amilaz enziminin, P. pastoris ile üretilmesi amaçlanmıştır. Bu kapsamda, PFA enzimini kodlayan gen, tasarlanan ileri ve geri primerle çoğaltıldıktan sonra pPICZalphaA plasmidine klonlanmıştır. P. pastoris X-33 suşu, pPICZalphaA:PFA plasmidi ile transfekte edildikten sonra erlenmeyer üretim ortamında rPFA enzim aktivetisinin varlığı saptanmış ve rekombinant enzimin biyokimyasal karakterizasyonu yapılmıştır. rPFA'nın optimum 95 Celcius sıcaklık ve pH=4.5-6.5 aralığında metal iyonlarına ihtiyaç duymadan çalıştığı, divalent metal iyonları varlığında inhibe olduğu saptanmıştır. Saccharomyces cerevisiae alfa-faktör salgı sinyalinin enzimin amino ucuna eklenmesine rağmen hücre-dışı enzim aktivitesi düşük hücre-içi enzim aktivitesi yüksek bulunmuştur. En iyi rPFA üreticisi olan suş, hücre-içi enzim aktivitelerinin DNS metodu ile belirlenmesiyle saptanmıştır. Enzim üretimi ve hücre çoğalması üzerine pH etkisi, erlenmeyer deneyleri ile incelenmiş, pH=6 tampon çözeltisinde 4800 U/l alfa-amilaz aktivitesi ve 7.30 g/l yaş hücre derişimi tesbit edilmiştir. Daha yüksek miktarda rPFA üretmek amacıyla pH=4 ve pH=5 pH kontrollü işletim koşullarında, 1 litre çalışma hacminde iki farklı biyoreaktör deneyi tasarlanmıştır. Her iki deneyde de spesifik hücre çoğalma hızını 0.03 h-1 de tutacak şekilde önceden belirlenen üstel metanol besleme stratejisi kullanılmıştır. En yüksek ?-amilaz aktivitesi pH=4 koşulunda, üretim fazının t=27 st'inde, yaş hücre derişimi 209 g/l iken 73,400 U/l olarak belirlenmiştir.

In this study, it was aimed to express the P. furiosus extracellular alpha-amylase (PFA) in Pichia pastoris. In this context, PFA coding cDNA frame was cloned into pPICZalphaA expression vector. Then wild type P. pastoris X-33 cells were transfected with pPICZ?A