A global approach to the hydrogen production, carbon assimilation and nitrogen metabolism of rhodobacter capsulatus by physiological and microarray analyses

Abstract

Fotofermentasyon sürecinde hidrojen üretimini etkileyen en önemli parametrelerden biri karbon ve azot kaynaklarının türüdür. Bu nedenle bu araştırmada, farklı azot kaynaklarının (5mM amonyum klorür ve 2mM glutamat) ve asetat konsantrasyonlarının (40-80mM) R. capsulatus'un metabolizması üzerine etkisi incelenmiştir.İlk olarak, farklı azot kaynakları ve asetat konsantrasyonlarında R. capsulatus'un büyüme, hidrojen üretimi ve substrat kullanım davranışlarını karşılaştırmak için fizyolojik deneyler yapılmıştır. Hidrojen üretimi, karbon asimilasyonu, azot metabolizması ve bunların denetim mekanizmalarının daha iyi anlaşılması için mikrodizin analizi yapılmıştır. Bu amaca yönelik olarak R. capsulatus için bir Affymetrix çipi tasarlanmış ve üretilmiştir. R. capsulatus bakterisinden miktar ve kalite olarak mikrodizin deneylerinde kullanılabilecek yeterlilikte RNA eldesi sağlayan bir izolasyon prosedürü optimize edilmiştir. Mikrodizin deneylerinin ve R. capsulatus çipinin doğrulanması eş zamanlı kantitatif PZR analizi ile gerçekleştirilmiştir.5mM amonyum klorür içeren besiyerinde 2mM glutamat içeren besiyerine göre; asetatın taşınması, asimilasyonu ve kullanımıyla ilişkili genlerin ifadesi anlamlı bir şekilde artmıştır. Diğer taraftan, nitrojenaz enzimini kodlayan genlerin ifadesi amonyum klorür içeren besiyerinde belirgin bir şekilde azalmıştır.Asetat asimilasyonunda rol alan genlerin ifadesinde 80mm asetatta 40mm asetat ile karşılaştırıldığında anlamlı bir fark görülmemiştir. Ancak sitrik asit döngüsü, fotosentetik aparat, elektron taşıma ve Calvin döngüsü ile ilişkili genlerin ifadesi 80mM asetat içeren ortamda anlamlı ölçüde azalmıştır.Mikrodizin veri analizi sonuçlarına bakıldığında, Rhodobacter capsulatus'un asetat asimilasyonunu iki farklı yolla glioksilat çevrimi ve / veya etilmalonil-KoA yolağı kullanılarak gerçekleştirebileceği ilk kez önerilmiştir.

One of the most important parameters affecting hydrogen production in photofermentation process is the type of carbon and nitrogen sources. For this reason in this research, the effect of different nitrogen sources (5mM ammonium chloride and 2mM glutamate) and acetate concentrations (40-80mM) on metabolism of Rhodobacter capsulatus were investigated.First of all, physiological experiments were carried out to compare growth, hydrogen production and substrate utilization behaviors of R. capsulatus on different nitrogen sources and acetate concentrations. For further understanding of hydrogen production, carbon assimilation and nitrogen metabolism; microarray analysis were conducted. For this purpose, an Affymetrix GeneChip for R. capsulatus was custom designed and manufactured. An efficient RNA isolation protocol from R. capsulatus was optimized for use of microarray analysis. Validation of the microarray experiments and custom designed R. capsulatus were carried out by RT-qPCR analysis.On 5mM ammonium chloride containing medium, transcription of genes related to transport, assimilation and utilization of acetate were significantly up-regulated compared to 2mM glutamate medium. On the other hand, nitrogenase enzyme encoding genes were significantly down-regulated on ammonium chloride containing medium.Although transcription of genes that take role in acetate assimilation did not show a significant difference on 80mM acetate compared to 40mM acetate; TCA cycle, photosynthetic apparatus, electron transport and Calvin cycle related genes were significantly down-regulated on 80mM acetate.From microarray data analysis results, it was suggested for the first time that Rhodobacter capsulatus might assimilate acetate by using two different routes using glyoxylate cycle and/or ethylmalonyl-CoA pathway.