Characterization of molecular-level changes due to MicroRNA-125b expression in breast cancer cells by spectroscopic and chemometric analysis techniques

Abstract

MikroRNA (miRNA)lar 22 nükleotit uzunluğunda kodlanmayan RNA molekülleridir ve hedef mRNAların 3' UTR (translasyon olmayan bölge) bölgelerine bağlanmak suretiyle post-transkripsiyonel gen ifadesini düzenlerler. Hücrede birçok farklı olayda ve yolakta önemli rolleri olması nedeniyle, ekspresyonlarında bozukluk olduğunda, tümoregenez, metastaz ve ilaç dirençliliği gibi hastalık mekanizmalarıyla ilişkili oldukları belirtilmiştir. Bununla birlikte, söz konusu mikromüdürlerin kanser hücre metabolizmasında düzenleyici rolleri olduğu gösterilmiştir. Bugüne kadar önemli sayıda miRNA ve hedef mRNAları tanımlanmış ve doğrulanmıştır. Tek miRNA bir çok mRNA'ya bağlanabileceğinden dolayı, bu moleküllerin kanser etiopatojenezi ve metabolizmasındaki rollerini açığa çıkarmak oldukça zordur. Bu yüzden, bu moleküllerin kanserdeki global rollerini açığa çıkarmak için hem deneysel hem de data analiz metodları gereklidir. Bu tez çalışmasında miRNA ekspresyonunun hücrelerde nasıl değişikliklere yol açtığını global seviyede belirleyebilmek için, kontrol grubuna göre, miR-125b ekspresyonuna bağlı meme kanseri hücreleri molekülllerinde özellikle lipitlerin içerik ve yapıları ile membran dinamiğinde meydana gelen değişimleri incelemek amaçlandı. miR-125b'nin meme kanserinde en çok ifadesi azalan miRNAlardan biri olması nedeniyle, söz konusu miRNAnın ifadesi meme kanseri hücre hattı sistemlerinde araştırıldı. miR-125b (MCF7-125b, T47D-125b) ve boş vektörle (MCF7-EV, T47D-EV) transfekte edilmiş MCF7 ve T47D hücreleri ile çalışılmıştır. Global moleküler değişimler ve özellikle hücre lipitlerindeki değişimler Azaltılmış Total Yansıma Fourier Dönüşüm Kızıl Ötesi (ATR-FTIR) Spektroskopisi ile belirlendi. Membran dinamiğindeki değişimler spin etiketleme yöntemi olan Elektron Spin Rezonans (ESR) Spektroskopisi ile elde edildi. Bu tekniklere ilaveten, boş vektör ve miR-125b transfekte edilmiş meme kanseri hücrelerini birbirinden ayırmak amacıyla, hücre spektrumlarına Temel Bileşen Analizi (PCA) ile Hiyerarşik Kümeleme Analizini (HCA) kapsaayan gözetimsiz kemometrik analiz metotları uygulandı. Spektral sonuçlar miR-125b transfekte olmuş hücrelerde boş vektörle transfekte edilen hücrelere göre doymuş ve doymamış lipitler ile RNA ve protein içeriğinde azalma olduğunu gösterdi. MCF7 hücrelerinde glikojen, kolesterol ester ve trigliserit miktarında azalma bulunurken T47D hücrelerinde ise zıt sonuçlar elde edildi. MCF7 hücrelerinde membran akışkanlığında azalma elde edilirken, T47D hücrelerinde artma elde edildi. miR-125b ifadesine bağlı her iki hücre hattında da, fosfolipit, fosfatidilkolin, sifingolipit ve sifingomiyelin içeriklerinde azalış gözlendi. Bu değişimlere bağlı olarak, PCA ve HCA analiz yöntemleri ile boş vektör ve miR-125b transfekte hücreler birbirinden başarılı bir şekilde ayrıldı. Bu çalışma ile, hücrelerde miRNAların global etkilerini anlamak için yenilikçi bir yaklaşım önerildi. Kemometrik analiz yöntemleri ile birlikte kızılötesi spektroskopisinin potansiyel uygulamaları sadece araştırma alanları ile sınırlı değildir. Bu tarz öncü çalışmalar, hasta örneklerinde miRNA ifade bozukluğunun belirlenmesi için diyagnostik metotların geliştirimesine de ışık tutatacaktır.

MicroRNAs (miRNAs), are 22 nucleotides long, non-coding RNAs that control gene expression post-transcriptionally by binding to their target mRNA's 3' UTRs (untranslated regions). Due to their crucial roles in various important regulatory processes and pathways, miRNAs have been implicated in disease mechanisms such as tumorigenesis, metastasis and drug resistance when their expression is deregulated. Moreover, the regulatory roles of these micromanagers have been demonstrated in the metabolism of cancer cells. To date, a significant number of miRNAs and their target messenger RNAs (mRNAs) have been identified and verified. Since one miRNA can target many mRNAs, it is hard to delineate the roles of these molecules in etiopathogenesis and metabolism of cancers. Therefore, to uncover the global roles of these molecules in cancer, both experimental and data analysis methods are required. The current thesis study aimed to examine the alterations in the membrane dynamics, content and structure of molecules especially lipids of miR-125b expressing breast cancer cells compared to controls to obtain a more holistic view of how miRNA expression alters cells. miR-125b expression in breast cancer cell line systems was investigated since this is one the most down-regulated miRNAs in breast cancer. MCF7 and T47D cells stably transfected with miR-125b (MCF7-125b, T47D-125b) and empty vector (MCF7-EV, T47D-EV) were studied. Global molecular changes and specifically the changes in cellular lipids were determined by Attenuated Total Reflectance Fourier Transform Infrared (ATR-FTIR) Spectroscopy. The alterations in membrane dynamics were identified by spin-labelling Electron Spin Resonance (ESR) spectroscopy. In addition to these techniques, to discriminate between EV and miR-125b transfected breast cancer cells, unsupervised chemometric analysis methods including principal component (PCA) and hierarchical cluster analyses (HCA) were applied to the infrared spectra. The spectral results revealed lower saturated and unsaturated lipids, RNA and protein content in both miR-125b transfected breast cancer cells relative to the EV cells. The amount of glycogen, cholesterol ester and triglyceride was found to be decreased in MCF7 cells but opposite results were obtained for T47D cells. The decreased membrane fluidity was acquired in MCF7 cells but for T47D cells an inverse result was obtained. The decline in phospholipid, sphingomyelin, phosphatidyl-choline, sphingolipid and sphingomyelin contents were also observed in both cell lines with miR-125b expression. Based on these alterations, both EV and miR-125b cells lines were discriminated successfully by PCA and HCA methods. Here, a novel approach was proposed to understand the global effects of miRNAs in cells. Potential applications of infrared spectroscopy coupled with chemometric methods are not only limited to research area. This kind of pioneer studies will shed light on the development of future diagnostic tools for deregulated miRNA expression in patient samples.