Development of an integrated lab-on-a-chip (LOC) platform for multidrug effect analysis

Abstract

Bu tezde, tekil kanser hücreleri üzerindeki kemoterapi ilaçların sitotoksisitesini izlemek için normalde kapalı elektrostatik mikrovalfler ile entegre edilmiş, damlacık tabanlı çoklu ilaç analiz platformunun alt ünitelerinin analizi, tasarımı, üretimi ve testi sunulmaktadır.Daha etkili ve kişiselleştirilmiş bir kemoterapi için, bir hastanın cevap vereceği uygun ilaç dozajının değerlendirilebileceği hücre canlılık oranını izleyen canlı dışı kemosensitivite deneyleri gereklidir. Kanser heterojenliğinin ortaya çıkarılması, tekil hücreler üzerinde hassas bir fonksiyonel analiz gerektirir; fakat, bir hasta için etkili olacak ilaç rejimlerinin seçilmesinde yardımcı olabilir. Bu konuda, en önemli tekniklerden biri, tekil hücrenin izole edilmiş ortamda, yüksek verimli bir şekilde kapsüllenmesini sağlayan ve küçük hacimlerde analizlerin gerçekleştirilmesine olanak tanıyan mikroakışkan damlacıkların kullanılmasıdır.Sunulan çip üzerinde laboratuvar platformu, hücreler üzerinde kemoterapötik ajanların farklı kombinasyonlar ve dozajlarda etkisini gözlemlemek üzere tasarlanmıştır ve tek bir çip üzerinde karıştırma, hücre odaklama, damlacık oluşumu ve canlı dışı sitotoksisite taramasını içerir. Entegre elektrostatik mikrovalfler, ilaç akışının kontrolüne ve damlacıkların mikroakışkan cihaz içinde yönlendirilmesine izin verir.İlgili teorik kavramlar, CFD simülasyonları ve test sonuçları mikroakışkan yapının alt sistemleri olan pasif mikrokarıştırıcı, akış odaklayıcıda damlacık oluşumu ve hidrodinamik hücre odaklayıcı için ayrı olarak sunulmuştur. Mikrokarıştırıcı yapısına ilişkin simülasyonlar ve deneysel sonuçlar, geniş bir Reynolds sayısı aralığındaki numune akışları için %80'in üzerinde bir karışım verimliliği elde etmenin mümkün olabileceğini göstermektedir. Dağınık ve sürekli fazların akış hızlarına göre damlacık büyüklüğü dağılımının elde edilmesine yönelik simülasyonlar ve deneysel çalışmalar, 50 μm çapında damlacıkların yüksek bir üretim hızında (>1000 kHz) elde edilebileceğini göstermiştir. Ayrıca, pasif mikrokarıştırıcının hücreleri mikrokanalın ortasına hidrodinamik olarak odaklayarak, tek hücre hapsetme başarımını (%42'ye kadar) arttırdığı gösterilmiştir. Doksorubisinin damlacık içine hapsolmuş K-562 lösemi kanser hücreleri üzerindeki etkisi, 2 saat boyunca floresan yoğunluğu değişimi gözlemlenerek ölçülmüş ve ilaca maruz kalmayan bir kontrol grubu ile karşılaştırılmıştır.Elektrostatik mikrovalfin modellenmesinde, bükülme miktarını ve çekme voltajını belirlemek için analitik modeller ve FEM analizi kullanılmıştır. Üretilen mikrovalf prototipleri çekme gerilimi ve tepki verme süresini karakterize etmek için test edilmiştir. Çekme gerilimi, 300 µm diyafram yarıçapı için 122 ± 10,65 V civarında ölçülmüştür. Çekme geriliminin deneysel olarak elde edilen değeri, sayısal ve analitik çalışmalarla tutarlıdır. Hem açılış hem de kapanma durumlarında tepki süreleri, farklı valfler için 1-3 saniye arasında olduğu gözlemlenmiştir. Ayrıca, PDMS mikrokanallar ile kapatılan diyaframlar, önerilen kanal entegrasyonunun, mikrovalf çalıştırıldığında, sıvı akışına izin verdiğini kanıtlamak üzere akış altında test edilmiştir.

This thesis presents analysis, design, fabrication, and testing of microfluidic sub-units designed for a droplet-based multidrug analysis platform. The platform is integrated with normally closed electrostatically actuated microvalves to monitor cytotoxicity of anticancer drugs on single cancer cells encapsulated in microdroplets. Here, elucidation of cancer heterogeneity requires precise functional analysis at single-cell levels which can assist to select effective drug regimens for personalized chemotherapy. One preeminent technique is to utilize droplet microfluidics which enable encapsulation of single cell in its isolated immediate environment in a high-throughput manner and allow to carry out cell-based assays in tiny volumes.The lab-on-a-chip platform is designed to observe the effect of different combinations and dosages of chemotherapeutic agents on K562 leukemia cells and includes mixing, cell focusing, droplet formation and in vitro cytotoxicity screening all in a single chip. Integrated electrostatic microvalves permit the control of drug flow and routing of droplets within microfluidic device. A review of theoretical concepts, corresponding Computational Fluid Dynamics (CFD) simulations and test results are presented separately for microfluidic sub-systems: passive micromixer, droplet formation in a flow-focusing junction, inertial microfluidics for cell focusing. Then, they combined to compose a full droplet screening workflow. Evaluating both experimental results and numerical simulations regarding the contraction-expansion type micromixer structure indicates that it is possible to achieve a mixing efficiency over 80% for sample flows with a wide range of Reynolds numbers. Droplet size distribution controlled by the volumetric flow rates of dispersed and continuous phases is obtained both numerically and experimentally and the studies validate that droplets with an effective size around 50 μm can be generated by adjusting the flow rates of both phases at a high generation rate (>1000 kHz). Moreover, it is shown that the passive micromixer enhances the single-cell encapsulation ratio to a certain degree (up to %42) by hydrodynamically focusing the cells to the middle of the microchannel. The effectivity of doxorubicin on K-562 leukemia cancer cells confined in drug-media drops is measured at single-cell level based on the fluorescence intensity change over 2 hours and compared with a control group which is not exposed to the drug.While modeling the electrostatically actuated microvalve, both analytical models and Finite Element Analysis (FEM) analysis regarding pull-in voltages and displacements are included. Fabricated prototypes are tested to characterize microvalve behavior for pull-in voltage, repeatability, response times and touch area during actuation. Pull-in voltage is measured around 122 ± 10.65 V. The experimental value of pull-in voltage is closely consistent with numerical and analytical studies. Response times for both opening and closing states observed between 1-3 seconds for different valves. Moreover, fabricated moving diaphragms which are sealed with PDMS microchannels are tested under flow to prove that the proposed channel integration allows fluid flow underneath the valve seat when the valve is actuated.