Mitokondriyal miRNA`ların (mitomiR) Meme Kanseri Hücre Hatlarında Araştırılması

Abstract

Kadınlarda en sık görülen meme kanseri %5 genetik yatkınlıkla ilişkilidir veotozomal dominant kalıtımlıdır. Mitokondri; metabolizma, hücre ölümü ve inflamasyongibi önemli hücresel olaylarda rol almaktadır. Bu hücresel olayların basamaklarında,küçük RNA'ların (sRNA), özellikle miRNA'ların önemli rol oynadıkları mRNA ve proteinseviyelerini kontrol ettikleri bilinmektedir. Son yıllarda yapılan çalışmalar olgunmiRNA'ların yanı sıra pre-miRNA'ların da mitokondride yer aldıklarını ve proteinlerinbölgeye özgü regülasyonlarını belirlemede mitokondrinin önemini vurgulamaktadır. Buçalışmada meme kanseri hücre hatlarında, mitokondriyal miRNA'ların muhtemelrollerinin belirlenmesi amaçlandı.Araştırmada, MCF-10A, MCF-7 ve MDA-MB-231meme kanseri hücre hatlarından 'Magnetic Activated Cell Sorting (MACS)' yöntemi ilemitokondriyal fraksiyonlar hazırlandı. Bu fraksiyonlar RNAse A ile yıkanarak sitozolikkontaminasyonun uzaklaştırılması sağlandı. Mitokondriyal DNA tarafından kodlanangenlerin ekspresyonlarının değerlendirildiği mtRNA örneklerinde ekspresyondeğişimleri qRT-PCR ve yeni nesil dizileme yöntemleri ile teyit edildi. Küçük RNAdizileme analizi sonucu belirlediğimiz miRNA'ların fonksiyonlarını analiz etmekamacıyla web tabanlı DIANA biyoinformatik analiz programı kullanıldı ve anlamlıbulunan miRNA'ların hangi biyolojik süreç, moleküler işlev ve biyokimyasal yolakta yeraldığını belirlemek için Gen Ontoloji (GO) ve Kyoto Encyclopedia of Genes andGenomes (KEGG) yolak analizleri Fischer's exact testi metoduyla değerlendirildi.Mitokondriyal genom tarafından kodlanan miRNA'ların mitokondriyal genomdakipozisyonları SerialCloner 2-6-1 programı kullanılarak belirlendi. Araştırmada,mitokondri ile ilişkili en sık belirlenen miRNA hsa-miR-6087-5p, hsa-miR-3960-3p, hsamiR-7641-5p, hsa-miR-3648-3p, hsa-miR-4488-5p, hsa-miR-4485-5p, hsa-miR-4449-3p, hsa-miR-4484, let-7 ailesi üyeleri (let-7a,b,c,d,e,f,g,i), hsa-miR-1290-3p, hsa-miR-423-5p olmakla birlikte miR-221-3p, miR-92a-3p, hsa-miR-1246-5p, hsa-miR-1275-5p,hsa-miR-663a-5p, miR-25-3p, miR-23a-3p, hsa-miR-423-5p, hsa-miR-320a-3p'damitokondri ile ilişkili bulundu. Analiz sonucuna göre; hsa-miR-4461, hsa-miR-4484 vehsa-miR-4485'nın mitokondriyal genom tarafından sırasıyla ND4L, L-ORF ve 16SrRNA genleri ile homoloji gösteren ve mitokondriyal genomdaki pozisyonlarının(10689–10711) , (5747–5763) ve (2539–2554) olduğu belirlendi.Tanımlı miRNA'ların yanısıra ilk kez mitokondriyal gen bölgeleri ile homolojigösteren novel miRNA dizileri de saptandı. Mitokondride lokalize olan veya ilişkili olanmiRNA'ların insan sağlığı ve hastalıklar üzerine etkilerinin ve biyolojik önemlerininaydınlatılabilmesi için daha fazla araştırmaya ihtiyaç vardır.

Breast cancer which is the most common cancer type among women have anautosomal dominant inheritance pattern, as well as 5% of them are being associatedwith genetic predisposition. The cellular processes are controlled at mRNA andproteins levels in mitochondria, where small RNAs (sRNAs) especially miRNAs playcritical roles. The recent studies have led the understanding that mitochondria are oneof the destinations of pre-miRNAs besides mature miRNAs. The newly destination ofmiRNAs suggest the role of mitochondria in following-up site specific regulations ofproteins as well as the function of mitochondria. In this study we aimed to identifypossible roles of mitochondrial miRNAs in breast cancer cell lines. Therefore,mitochondrial fractions were prepared from MCF-10A, MCF-7 and MDA-MB-231 cellsby using 'Magnetic Activated Cell Sorting (MACS)' methodology. Fractions weretreated with RNase A in order to remove cytosolic contaminants. In mtRNA samplesexpression changes were evaluated both qRT-PCR and next generation sequencing.As a result of small RNA sequencing, in order to identify the functions of miRNAs, aweb based tool was used. Gene ontology and Kyoto Encyclopedia of Genes andGenomes (KEGG) pathway analysis were evalutated by Fisher's exact test method.Genomic positions of mitochondrial encoded miRNAs were detected by usingSerialCloner 2-6-1 programme. hsa-miR-6087-5p, hsa-miR-3960-3p, hsa-miR-7641-5p,hsa-miR-3648-3p, hsa-miR-4488-5p, hsa-miR-4485-5p, hsa-miR-4449-3p, hsa-miR-4484, let-7 family members, hsa-miR-1290-3p and hsa-miR-423-5p was found to bemost relevant with mitochondria as well as miR-221-3p, miR-92a-3p, hsa-miR-1246-5p,hsa-miR-1275-5p, hsa-miR-663a-5p, miR-25-3p, miR-23a-3p, hsa-miR-423-5p, hsamiR-320a-3p. hsa-miR-4461, hsa-miR-4484 and hsa-miR-4485 aligned tomitochondrial genome at positions (10689–10711), (5747–5763) and (2539–2554)corresponding to ND4L, L-ORF and 16S rRNA genes respectively.In this study besides known miRNAs, novel miRNAs which are shown to havehomology with mitochondrial genes were also identified. Further studies are requiredfor enlighting the biological importance and effects on human heealth of mitochondrialocalizedor related miRNAs.