İnsan büyüme hormonunun (BH-N) klonlanması, ekspresyonu ve izole büyüme hormonu eksikliği sendromunun genetik karakterizasyonu

Abstract

Postnatal büyüme üzerinde etkisi olan Büyüme Hormonu (BH) bazen çocuklarda ve erişkinlerde eksikliği sonucu Büyüme Hormonu Eksikliğine (BHE) neden olmakta ve rekombinant BH (rBH) ile tedavi edilmektedir. Ülkemizde rBH üretilmesi amacı ile kandan RNA izole edilmiş ve BH cDNA'sı klonlanmış ve Glutatyon S-Transferaz ile birleşik füzyon halinde BH bakterilerde eksprese edilmiş, saflaştırılmış ve biyolojik aktivitesi ex vivo'da gösterilmiştir. Ayrıca genomik BH geni kandan izole edilen genomik DNA kullanılarak klonlanmış ve memeli hücrelerinde eksprese edilmiştir.İzole Büyüme Hormonu Eksikliği (İBHE) sadece BH'nun eksikliği sonucu büyüme geriliğine neden olan rahatsızlıktır. Farklı etnik kökene sahip İBHE çocuklarda BH geninde mutasyonlar tespit edilmiştir. Türk İBHE çocuklarında BH-N geninde mutasyon taraması için 76 İBHE çocuktan alınan kandan genomik DNA izole edilmiş ve BH geni Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) ile çoğaltılarak büyük delesyon varlığı incelenmiştir. Küçük delesyon, insersiyon ile nükleotit değişikliği PCR ürünlerinin dizi analizi ile irdelenmiştir. BH-N geninin içinde bulunduğu 6.6 kb delesyon, heterozigot durumda Glutamik asitin Glisin (E33G), Asparajinin aspartik asit (N47D), Treoninin Alanin (T-24A) yanlış anlam mutasyonları ile homozigot durumda Alanin Serin (A13S) yanlış anlam mutasyonu ile Triptofanın dur koduna (W-7X) anlamsız mutasyonları belirlenmiştir. Ayrıca BH-N geninin 1. intronunda GAAA insersiyonu ve intron 1 de sitozin (+83CDel) ile BH proteinin 166. amino asidi Fenilalanin delesyonu (F166Del) mutasyonları tespit edilmiştir. Belirlenen mutasyonlara göre mutant BH geni klonlanmış ve BHR bağlanarak sinyal iletimini başlatması açısından lusiferaz deneyi ile mutasyonların fonksiyonları incelenmiştir. W-7X, E33G, F166Del, A13S ve N47D mutasyonlarının BH biyolojik aktivitesini düşürdüğü ama T-24A, GAAA insersiyon ve +83CDel mutasyonlarının BH biyolojik aktivitesi üzerinde etkisinin olmadığı tespit edilmiştir.

Growth hormone (GH) which has an effect on postnatal growth was sometimes deficient both in children and adults leading Growth Hormone Deficiency Syndrome (GHD). Recombinant GH (rGH) is used as a treatment for these cases. In order to produce rGH in our country, we isolated RNA from blood and cloned GH cDNA and rGH was expressed in bacteria as a fusion protein with Gluthatione S-Transferase. It was purified and biological activity was shown in ex vivo. Genomic GH gene was cloned from genomic DNA isolated from blood and expressed in mammalian cells.Isolated Growth Hormone Deficiency (IGHD) is a medical condition of insufficient production of growth hormone (GH) that is caused by mutations on GH-N gene in different ethnic origin children. In order to screen GH-N gene mutations in Turkish IGHD children; we isolated genomic DNA from 76 children?s blood. Macrodeletions on GH-N gene were detected by PCR, microdeletions and insertions and nucleotide substitutions were detected by DNA sequencing of PCR products. 6.6 kb macrodeletion including only GH-N gene, Glutamic acid to Glysine (E33G), Asparagine to Aspartic acid (N47D), Threonin to Alanin (T-24A) missense mutations in heterozygote state and one missense mutation Alanine to Serine (A13S) substitution and one nonsense mutation Tryptophane to stop codone (W-7X) in homozygous state were observed. GAAA insertion in intron 1 of GH-N gene and both intron 1 (+83C) deletion and deletion of 166. amino acid of GH protein phenilalanin (F166Del) mutations were detected. Mutant GH-N genes including these mutations were cloned and functional analysis of mutations were detected by binding of GHR with mutant GH by lusiferase assay. It has been observed that W-7X, E33G, F166Del, A13S and N47D mutations lead to a decrease in GH biological activity. However T-24A, GAAA insertion and deletion of +83C mutations have no biological activity disfunction.