A multiplex primer design algorithm for target amplification of continuous genomic regions

Abstract

Hedeflenmiş Yeni Nesil Sekanslama (YNS) testleri Sanger sekanslamaya göre maliyetetkinve güvenilir alternatiflerdir. Hedef zenginleştirme yaklaşımı çok sayıda genkümeleri için uygundur. Ancak, daha küçük bölgeler için hedef çoğaltma yöntemlerihedef zenginleştirme ve Sanger sekanslamaya göre daha etkindir. Hedef çoğaltmayönteminin en büyük zorluğu ise gerekli zaman, ekipman ve işgücü göz önünealındığında amplikonların çoğaltılmaya hazır hale getirilmesidir. Multipleks PCR (MPCR)bahsi geçen problem için iyi bir çözüm oluşturmaktadır. Ancak uygun multipleksçiftlerin bulunması bir klik kararı problemidir ve doğası gereği NP-tam'dır.Bu çalışmada kesiksiz genomik bölgeler için MPCR primerleri tasarlayan yeni biryöntem öne sürülmektedir ve klinik açıdan güvenilir PCR tasarımı iyi uygulamalarıbenimsenmiştir. Birçok faktörün 48 farklı kombinasyonuyla oluşturulan deneyselorganizasyon ile farklı parametrelerin ilk makul çözümün bulunmasını etkilediğigösterilmiştir. İlk primer adayı seçme bölgesinin uzunluğunun arttırılmasının daha iyisonuçlar verdiği, ancak aynı şartlarda daha uzun süre beklemenin ilk makul çözümübulma açısından anlamlı bir etkisinin olmadığı görülmüştir.MEFV tüm geni için MPCR primer tasarımı gerçekleştirilmiş ve değerlendirmedeneylerimize dayanarak, öne sürülen MPCR yaklaşımının makul bir zaman dilimiiçerisinde verilen bir sekans için güvenilir YNS test primerleri üretebildiği gösterilmiştir.

Targeted Next Generation Sequencing (NGS) assays are cost-efficient and reliablealternatives to Sanger sequencing. For sequencing of very large set of genes, thetarget enrichment approach is suitable. However, for smaller genomic regions, thetarget amplification method is more efficient than both the target enrichment methodand Sanger sequencing. The major difficulty of the target amplification method is thepreparation of amplicons, regarding required time, equipment, and labor. MultiplexPCR (MPCR) is a good solution for the mentioned problems. However, findingcompatible multiplex pairs is an example of a clique decision problem in graph theoryand it's NP-complete by nature.We propose a novel method to design MPCR primers for a continuous genomicregion, following the best practices of clinically reliable PCR design processes. On anexperimental setup with 48 different combinations of factors, we have shown thatmultiple parameters might effect finding the first feasible solution. Increasing the lengthof the initial primer candidate selection sequence gives better results, whereas waitingfor a longer time to find the first feasible solution does not have a significant impact.We generated MPCR primer design for the MEFV whole gene; and, our benchmarkingexperiments show that the proposed MPCR approach is able to produce reliable NGSassay primers for a given sequence in a reasonable amount of time.