Toprak bakterilerinden ekstraselüler pektinaz üretimi, izolasyonu ve karakterizasyonu

Abstract

Bu çalışma bakterilerde, asidik pektinazlara nazaran, daha nadir görülen alkali pektinazların saflaştırılması ve karakterizasyonunu kapsamaktadır. Bakteri kaynağı için, Koyulhisar (Sivas, Türkiye) elma bahçeleri toprak örnekleri kullanıldı. Elde edilen izolatlar kısmi protein (kütle spektrometri) ve 16S rRNA geni dizi analizleriyle tür düzeyinde tanımlandı. Tümünün Bacillus clausii üyeleri oldukları belirlendi. Bu izolatlarla kültürler hazırlandı ve hücreler uzaklaştırıldıktan sonra üst sıvıda bulunan proteinler organik solvent yardımıyla çöktürüldü. Pektinaz taraması yapılırken ortamda mevcut bir proteazın diğer proteinleri sindirdiği fark edildi. Kültür hazırlamada kullanılan ortam sıcaklığı 55oC'e çıkarılarak bu proteolitik aktivite elimine edildi. Sonrasında poligalakturonaz, pektin liyaz, pektat liyaz ve pektin metilesterazdan oluşan dört farklı enzim akivitesi saptandı. Bu aktivitelere karşılık gelen dört protein bandı, 80 kDa, 58 kDa, 46 kDa ve ~28 kDa, SDS-PAGE ile görüntülendi. Bu enzimlerin herbiri için optimum pH, sıcaklık ve özgün substratlar varlığında zimogram analizleri yapıldı. En küçük protein bandının (28 kDa) pektin metilesteraz olduğu anlaşıldı. Bu enzimin Km ve Vmax değerleri sırasıyla 0,4 ve 217U'dur. Bacillus clausii genelde probiyotik ve proteaz üreticisi olarak bilinmektedir. Literatürde bu türün pektinaz enzimleri üzerine yapılmış araştırmalar oldukça sınırlıdır. Bu nedenle, bu çalışmanın başlıca özgün sonucu dört farklı pektinaz aktivitesinin saptanmasıdır.

This study involved the purification and characterization of relatively rarer alkaline pectinases in bacteria, compared to acidic pectinases. For the bacterial source, Koyulhisar (Sivas, Turkey) apple orchard soil samples were used. The isolates were identified at the species level by partial protein (mass spectrometry) and 16S rRNA gene sequence analyses. They all belonged to Bacillus clausii. Cultures were prepared with these isolates and after removal of the cells; the proteins in the supernatant were precipitated with organic solvents. When performing pectinase screening, it was noticed that a protease activity present in the precipitate was degrading the other proteins. This proteolytic activity was eliminated by increasing the ambient temperature to 55°C. Four different enzyme activities then determined were polygalacturonase, pectin lyase, pectate lyase, and pectin methylesterase. Four protein bands at 80 kDa, 58 kDa, 46 kDa, and ~ 28 kDa, corresponding to these activities were visualized by SDS-PAGE. For each of these enzymes, zimogram analysis was performed at optimum pH, temperature, and using specific substrates. The Km and Vmax values of this enzyme were 0,4 and 217U, respectively. Bacillus clausii is generally known as a probiotic and protease producer. In the literature, research on pectinase enzymes of this species has been quite limited. Therefore, the main specific result of this thesis was the study of four different pectinase activities.