Diplolepis fructuum (Rübsaamen, 1895) Hymenoptera: Cynipidae)`nin larvasından lipolitik bir fraksiyonun saflaştırılması ve temel kinetik özelliklerinin belirlenmesi

Abstract

Diplolepis fructuum (Rübsaamen, 1895) Rosaceae türlerinde zararlara yol açan en önemli böcek türlerinden birisidir. Biyokimyasal veri elde etmek için laboratuvarımızda 2018'de başlatılan bu çalışma ile D. fructuum'un larvasından bir esteraz (E.C.3.1.1.X) Q sefaroz anyon değişim, fenil sefaroz CL-4B ve sefakril S100-HR jel filtrasyon kromatografisini kullanarak saflaştırılmıştır. Saflaştırılan enzim 6.94 U (mg protein)-1 spesifik aktivite, 28.80 kat saflık ve % 8.80 verime sahipti. Nativ-PAGE çalışmalarında sadece bir aktivite bandı gözlenmiştir. Nativ-PAGE ve SDS-PAGE tekniklerini kullanarak, esterazın mol kütlesi yaklaşık olarak 60 kDa olarak tahmin edilmiştir. Kinetik datadan, enzimin optimum sıcaklık ve pH'ı sırasıyla 40 °C ve 9.0 olarak belirlenmiştir. Enzim, 40 °C ve pH 8.0'da 4 saat kararlıydı. 4-nitrofenil bütirat (p-NPB) substrat olarak kullanılarak, Km ve Vmax değerlerinin 0.035 mM ve 1.41 µmol (mL dk)-1 olduğu bulunmuştur. Enzim en yüksek aktivitesini p-NPB (% 100) ve 4-nitrofenil asetat (% 52) üzerinde sergilemiştir. Tüm bu veriler enzimin diğer böcek türlerinden bildirilen esterolitik enzimlerden farklı kinetik özellik ve mol kütlesi ile bir esteraz olabileceğini önermektedir.

Diplolepis fructuum (Rübsaamen, 1895) is one of the important insect species that causes damages on Rocaceae species. With this study launched in our laboratory in 2018 to get a biochemical data, an esterase (E.C.3.1.1.X) from the larvae of D. fructuum was purified using Q sepharose anion exchange, phenyl sepharose CL-4B, and sephacryl S100-HR gel filtration chromatography, respectively. The enzyme had 6.94 U (mg protein)-1 specific activity, 28.80-fold purity, and 8.80 % yield. Only one activity band was observed in Native-PAGE studies. The molecular weight of the esterase was approximately estimated as 60 kDa using Native-PAGE and SDS-PAGE techniques. By the kinetic data, optimum temperature and pH for the enzyme was determined as 40 °C and 9.0, respectively. The enzyme was stable for 4 hours at 40 °C and pH 8.0. Km and Vmax values were found to be 0.035 mM and 1.41 µmol (mL dk)-1, using 4-nitrophenyl butyrate (p-NPB) as substrate. The enzyme exhibited its highest activities on p-NPB (100 %) and 4-nitrophenyl acetate (52 %). All of these data suggest that the enzyme might be a typical esterase with different kinetic properties and molecular weight than esterolytic enzymes reported from other insect species.